اصلاح قارچ خوراکی دکمه ای سفید قسمت 1

اصلاح قارچ خوراکی دکمه ای سفید، در میان قارچ های خوراکی، کار اصلاحی بر روی قارچ دکمه ای سفید، از همه مشکل تر است. در حقیقت مشکلات اصلاح این قارچ غالباً ناشی از چرخه زندگی و زیست شناسی خاص آن می باشد. اصلاح ژنتیکی قارچ های خوراکی به ندرت توسط تولیدکنندگان صورت می گیرد، زیرا برای اصلاح نژاد قارچ های خوراکی به یک آزمایشگاه مجهز و مهارتها و تخصص های ویژه ای نیاز می باشد. علاوه بر این امروزه فناوری های مبتنی بر انگلیسی  DNA اساس اصلاح مدرن تشکیل می‌دهند و این فناوری‌ها در اصلاح قارچ خوراکی نیز مورد استفاده قرار می گیرند، فناوری هایی که فراتر از توان علمی اکثر تولیدکنندگان قارچ میباشد.

مهم ترین مشکلات اصلاحی قارچ خوراکی دکمه ای سفید

فراوانی پایین همو کاریون ها

در  برنامه های به نژادی، هدف تجمع ژن های مطلوب در یک نژاد و یا استفاده از پدیده هتروزیس می باشد. از آنجاییکه هتروکاریون ها به ندرت با هم  تلاقی پیدا می کنند و به تبادل هسته می پردازند، تجمع ژن های مطلوب مستلزم در اختیار داشتن میسلیوهای منو کاریوتیک می باشد تا بتوانند با هم تلاقی یابند.

بدین صورت که هیف تک هسته ای  را با یک هیف  تک هسته ای سازگار دیگر طلاق ای داده، تا هیف هیبرید تولید شده ژن های مطلوب درهیف هیبرید تجمع می یابند. فراوانی این میسلیوم های هموکاریوتیک در نژادهای تجاری قارچ دکمه ای سفید، بسیار پایین است که یکی از مهمترین موانع در برنامه‌های به نژادی این قارچ محسوب می شود.

عدم امکان تشخیص متوکاریون ها از هتروکاریون ها

معمولاً تشخیص دقیق و سریع میسلیوم های  منو کاریو تیک ازهتریوکاریوتیک  از طریق مشخصات مورفولوژیکی امکان پذیر نیست. به عبارتی، از روی مشخصات ظاهری نمی توان مطمئن شد که منشا میسلیومی که در اختیار است است از یک بازیدیوسپور با دو هسته متفاوت، از یک بازیدیوسپور با دو هسته همسان و یا از یک بازیدیوسپور با یک هسته بوده است. در تمام این موارد، واحدهای سلولی میسیلیوم، چند هسته ای هستند و رشد رویشی نسبتاً مشابهی دارند.

برای تایید منو کاریون ها، به طور سنتی از آزمون میوه دهی استفاده می شود. این آزمون بر این اساس است که میسلیوم های  منو کاریو تیک عقیم بود و اندام باردهی تولید نمی کنند، ولی میسلیوم های هتروکاریوتیک بارور بوده و اندام‌های باردهی تولید می کنند اما این آزمون مشکل، وقت گیرو به شدت وابسته به شرایط محیطی (یعنی مدیریت دما و دی اکسید کربن، بهینه سازی بستر کشت و خاک پوششی و غیره) است ولذا دارای خطاهای  قابل توجهی می باشد.

در زمینه استفاده از برخی شاخصه های میکروسکوپی نیز مشکلاتی وجود دارد. مثلاً ارتباطات کلامپ که در اکثر قارچ های خوراکی دیگر، نشان دهنده و تایید کننده وضعیت دای  کاریو تیک  میسلیوم می باشد، در گونه های جنس آگاریکوس وجود ندارد.

 راندمان پایین تندش بازیدیوسپورها

در قارچ دکمه ای سفید، تندش بازیدیوسپورها عنوان در هر برنامه به نژادی، ضعیف و معمولاً ناهماهنگ است. همچنین  کشت های  اسپور به شدت در معرض آلودگی های باکتریایی قرار می گیرند. بنابراین وادار کردن اسپور ها به جوانه زنی و تولید کشت تک اسپوری خالص کاری دشوار و وقت گیر است.

روش های اصلاحی در قارچ خوراکی دکمه ای سفید

انواع مختلفی از روش های به نژادی برای قارچ دکمه ای سفید در طی چندین دهه اخیر (به ویژه پس از معرفی نژادهایU1 و U3 در اوایل دهه ۱۹۸۰)  پیشنهاد شده است. هر کدام از این روشها دارای مزایا و معایبی هستند. برخی از آنها در زمان خود کارآمدترین روش محسوب می شدند ولی در حال حاضر، چندان اهمیتی ندارند.

 معرفی مستقیم نژادها

یکی از راه های ساده و مستقیم به نژادی در قارچ خوراکی دکمه ای سفید به ویژه در کشورهای در حال توسعه، واردکردن نژادهای با عملکرد بالا از کشورهای توسعه یافته و سپس تکثیر رویشی آنها می باشد. اما این روش فقط برای دو یا سه دوره تولید اسپاون کارآمد است. به عبارتی، بعد از چندبار تکثیر رویشی متوالی، قدرت نژاد وارداتی پایین می آید و دیگر به خوبی نژاد مادری خود نیست.

جمع آوری ژرم پلاسم های وحشی

برخی کشورها (از جمله کشور ما) از نظر منابع قارچ های خوراکی وحشی و از جمله قارچ  دکمه ای سفید، غنی هستند. برخی از این قارچ های وحشی می توانند ژن یا ژن های مفیدی همچون مقاومت به یک یا چند بیماری را به نژادهای  تجاری انتقال دهند. در دو دهه اخیر، دسترسی به گستره ای از ژنوتیپ های وحشی قارچ دکمه ای سفید و همچنین استفاده از نشانگرهای مولکولی، به نژادی این کارت را وارد مرحله جدیدی کرده است. این امر به ویژه طی برنامه‌ای به نام  ARP (Agricus Resource Program که از سال 1988 در مرکز تحقیقات سیلوان (Sylvan) آمریکا تأسیس شده، در حال انجام است.

 انتخاب درون نژادی

 کشت بافت

کشت بافت عبارت از کشت قطعه‌ای از ناحیه کلاهک یا پایه قارچ در یک محیط کشت مصنوعی مناسب در آزمایشگاه می باشد در حقیقت هدف اصلی از کشت بافت، حفظ و تکثیر یک نژاد یا جدایه مرغوب است. عملکرد حاصل از کشت بافت یک نژاد کمتر از عملکرد نژاد والدی است و معمولاً نسل اول کشت بافت عملکرد بیشتری گاهی ناهنجاری های رشدی به چشم می خورد.

ناهنجاری های رشدی از مهم‌ترین مشکلاتی هستند که برای تولید کنندگان بذر و پرورش دهندگان قارچ به وجود می آید. عملاً موقعی که از این نژاد ها بذر تهیه  و این بذر برای تولید قارچ به کار می رود، عملکرد پایین و کیفیت نامرغوب خواهد شد.  در نوع شدید این وضعیت حتی ممکن است هیچ قارچی تولید نشود.

اصلی‌ترین هدف کشت بافت ، حفظ نژاد های مرغوب و سپس در صورت لزوم تهیه بذر از آنها برای تولید قارچ است. در حقیقت مفهوم تولید  کشت خالص نیز همین است. یعنی اشغال یک محیط کشت مناسب توسط هیف یکی از نژاد ها یا جدایه های  قارچ دکمه ای سفید بدون آلودگی باکتریایی یا قارچی، این کشت خالص برای تلقیح یک ماده زمینه ای مغذی نظیر دانه‌های غلات به کار میرود.

 کشت های تک اسپوری و چند اسپوری

یکی از اصلی ترین روشهای انتخاب درون نژادی، استفاده از کشتهای  تک اسپور و یا چند اسپوری است . این امر بر اساس تفاوت و تنوعی است که بازیدیوسپور ها با یکدیگر نشان میدهند. در اینجا باید توجه داشت که تک اسپورهای با منشأ هتریوکاریوتیک تک اسپورهای با منشاء منوکاریوتیک به دلیل وضعیت پلوئیدی خود ممکن است تفاوت رشدی نشان دهند ، اما  سوال این است درون تک اسپورهای هتریوکاریوتیک چه میتواند باشد؟

همانطور که گفته شد به دلیل اینکه تو  هسته غیره خواهری به درون یک بازیدیوسپور مهاجرت می کنند، قاعدتاً تمامی اسپورهای تولیدی در اکثر مکان های ژنی ، شبهه والد خود هتروزایگوس خواهند شد و ظاهراً نبایستی تنوعی مشاهده شود. اما در اینجا پدیده هایی که در ارتباط با  تقسیم میوز رخ می دهد ممکن است باعث ایجاد تنوع شوند. اول ممکن است در هنگام تقسیم میوز و به وجود آمدن هسته ها، در برخی مکان های ژنی به طور تصادفی کراسینگ آور رخ دهد و در نتیجه هنگامی که دو هسته غیرخواهری به درون یک بازیدیوسپور مهاجرت می کنند.

در برخی از مکان های ژنی خود دچار بازترکیبی و یا حتی هموزایگوسیتی شوند. همچنین ممکن است هنگامی که دو هسته مشابه خواهری به درون یک بازیدیوسپور مهاجرت می کنند. بر اثر کراسینگ آور مقداری هتروزایگوسیتی  در برخی مکان های ژنی به وجود آید. همین امر یکی از راه های شناخت این نوع هموکاریون های حقیقی که از بازیدیوسپورهای  با یک هسته میوزی  به وجودآمده‌اند و امکان باز ترکیبی وهتروزایگوسیتی  در مکان های ژنی را ندارند، می‌باشد نتیجه نهایی  آنکه درصدی از نتایج هتروکاریوتیک  معادل نصف احتمال وقوع کیاسما، بازترکیب خواهند شد.

دوم آنکه برخی آللها  ممکن است با پروموتور های جدید با نواحی تنظیمی سیس – اکتینگ (Cisacting) در ارتباط باشند و بالاخره آن که پدیده بازآرایی (Reassortment) کروموزوم ها در هسته های پلوئید جدید، ممکن است محیط تنظیمی جدیدی برای برخی  ژنها ایجاد نماید. این مکانیسم ها به ویژه می‌تواند صفات  با کنترل ژنتیکی از جمله سرعت رشد میسلیوم که یک صفت کمی محسوب می شود، را تحت تاثیر قرار دهد.

هنگامی که هدف از یک برنامه اصلاحی، انتخاب درون نژادی به ویژه بازیابی عملکرد یک نژاد باشد، استفاده از این تفاوت ها سودمند است. اما این روش فقط با عکس کشف و حفظ با ترکیبی ها( یا پتانسیل بازترکیب پذیری) در درون یک نژاد می‌شوند و برای استفاده از پتانسیل ژنتیکی چند نژاد باید روش‌های دیگری مورد استفاده قرار گیرند.

 تهیه نقش اسپور

برای انجام کشت های تک و چنداسپوری، ابتدا باید نقش اسپور( Spore print )تهیه شود . برای تهیه نقش اسپور، ابتدا یک عدد قارچ متوسط تازه قبل از اینکه پرده زیر کلاهک آن باز شده باشد، انتخاب می شود قسمت پایه قارچ قطع و کلاهک قارچ تمیز می شود. سپس پرده زیر کلاهک با چاقوی جراحی سترون حذف و کلاهک به یک  ظرف پتری بر روی  یک کاغذ صافی ضدعفونی شده منتقل میشود.

مجموعه حاضر به وسیله یک ظرف مناسب سترون مثلاً یک بستر پوشانده می شود. معمولاً بعد از ۷۲- ۴۸ ساعت، نقش اسپور در کاغذ صافی تشکیل می شود. کاغذ صافی حاوی نقش اسپور را می ‌توان به نوارهای باریکی تقسیم و این نوارها را در لوله های 1/8 میلی لیتری در محیطی خشک و سرد (حداکثر4 درجه سانتی گراد) حتی تا یک سال نگهداری کرد.

مکانیسم تندش بازیدیوسپورها

به منظور تندش بازیدیوسپورها ،باید  یک مایع تعلیقی از اسپورها تهیه کرد. این مایه تعلیقی ابتدا به صورت خیلی غلیظ تهیه و سپس برای رقت  مناسب آماده می شود. برای تنظیم رقت  مناسب اسپورها، از یک لام  گلبول شمار استفاده می شود. در طی تحقیقات نسبتاً زیادی که در دو دهه اخیر انجام شده از، رقت های  مختلفی برای تضمین موفقیت کشت اسپور، گزارش شده است.

اما آنچه که رایج است و بیشتر مورد اطمینان می باشد آن است که با استفاده ازلام  گلبول شمار، رقت  ۱۰۵ اسپور بر میلی لیتر تهیه و برای کشت در هر ظرف پتری، ۱۰۴×۲ اسپور از آن  برداشته می شود. در تمام این مراحل باید حداکثر سعی را به کار برد تا از هرگونه آلودگی اجتناب شود، چراکه کشت اسپور به آلودگی به ویژه آلودگی باکتریایی بسیار حساس است.

اصولا، بازیدیوسپورها به دو گروه تقسیم می شوند: گروه اول که تعداد آنها بسیار کم است (در حدود ۵ درصد کل بازیدیوسپورها)، در حقیقت تندش کننده‌های اولیه هستند و بدون تحریک خارجی و فقط با وجود رطوبت و محیط غذایی کافی، تندش می‌کنند. این گروه از بازیدیوسپورها از نوع اسپورهای باخواب برون زادی Exogenously dormant spores هستند.

برای آنکه تعداد تند ش کننده های  اولیه در یک کشت هاگ قارچ به اندازه کافی زیاد باشد، باید تراکم تراکم  بازیدیوسپورها برای جدا کردن تک اسپورها مناسب باشد و همچنین مقدار حجم مایع تعلیقی با سطح ظرف پتری متناسب باشد لذا بایستی رقت مایه تعلیقی اسپورها در حدود ۱۰۴× ۲ برای هر ظرف پتری معمولی با قطر ۱۰ سانتی متر باشد.

گروه دوم بازیدیوسپورها آنهایی هستند که اصطلاحاً تند ش کننده های  تاخیری نامیده می شوند. این دسته از بازیدیوسپورها برای تند ش علاوه  رطوبت و محیط کشت کافی، کننده دارند. در واقع این بازیدیوسپورها دارای خواب ساختمان (Constitutively dormant spores) هستند.

برای تحریک تندش این دسته ازبازیدیوسپورها، می ‌توان یک پرگنه یک هفته ای (به قطر ۲- ۱ سانتی متر) از کشت بافت قارچ دکمه ای سفید را در محیط کشت اسپور قرار داد. این کشتی از میسلیوم می‌تواند به دلایلی، بازیدیوسپورهای  تاخیری را تحریک به تندش کند. یکی از نظریات ای که در این ارتباط بیان شده آن است که در قطعه میسلیوم تحریک کننده یک ماده فرار به نام ایزو والرات (Isovalerate) وجود دارد که می تواند اکسیدکربن یکی ازملزومات تندش است.

گزینش تک اسپوری

با توجه به روشی که در کشت اسپور گفته شد، از ۵ تا ۱۲روز بعد از کشت اسپور، می‌توان منتظر تندش بازیدیوسپورها بود.  ابتدا هر کدام ازبازیدیوسپورهای تندش کرده (که لوله تندش آنها با میکروسکوپ و پرگنه آنها با چشم غیر مسلح قابل رویت باشد) به یک ظرف پتری حاوی محیط کشت مناسب منتقل می شود.

تقریباً- بعد از گذشت ۲۵- ۲۰ روز ، میسلیوم اینتک اسپور بیشتر سطح ظرف پتری را اشغال می کند. اگر از کشت های تک اسپور به اندازه کافی در اختیار باشد،  می‌توان تنوع مورفولوژیکی یکی محسوسی را در بین آنها مشاهده کرد. مرحله اول  گزینش تک اسپوری  نیز بر اساس همین تنوع است است. این تفاوت های مورفولوژیکی باعث ایجاد تیپ‌های رشدی مختلف می‌شود. هر تیپ رشدی خود از دو جز مهم، شکل پرگنه و سرعت رشد میسلیوم تشکیل یافته است.

ازنظرشکل پرگنه،می توان انواع رشته ای (Strandy)، پنبه ای (Cottony) و بدون میسیلیوم هوایی (Appressed) را مشاهده کرد. از نظر سرعت رشد نیز می توان انواع سریع متوسط، کند و بسیار کند را در کشتهای تک اسپور تشخیص داد. در جایی که هدف از انتخاب درون نژادی، بهبود عملکرد یک نژاد باشد، باید کشت های تک اسپوری را که تیپ رشدی آن ها از نوع رشته ای و سریع است، انتخاب و از آن ها بذر قارچ تهیه کرد.

می توان مشابه همین گزینش را نیز در مرحله اسپاون  برای انواع اسپاون های مربوط به کشت های تک اسپور انجام داد. اسپاون های انتخابی در آزمایشات میوه دهی در حجم کم و در نهایت در آزمایشات میوه دهی تکرار دار در حجم زیاد جهت ارزیابی دقیق مورد استفاده قرار می‌گیرند. اما در جایی که هدف، انتخاب انواع  ویژه ازتک اسپورها باشد، به نحوی که بتوان  از آنها در برنامه‌های هیبریداسیون درون نژادی استفاده کرد نحوه دیگری از گزینش باید انجام شود که در بخش‌های بعدی تشریح خواهند شد. شکل ۴ نشان دهنده تنوعی است که ممکن است در کشت های تک اسپری یک نژاد دیده شوند.

گزینش چند اسپوری

گزینش چند اسپوری یکی از قدیمی ترین و ساده ترین روش های گزینش برای قارچ دکمه ای است. برای گزینش چند اسپوری می‌توان به همان روشی که قبلا گفته شد، کشت اسپور انجام داده و سپس اجازه داد تا سطح ظرف پتر توسط  میسلیوم های ناشی از تند ش اسپورها اشغال شود. ۲۰- ۱۴ روز بعد، هر کشت چند اسپوری انواع مختلفی از تیپ های رشد را نشان  می‌دهد.

لذا از نواحی مختلف هر کشت، می‌توان زیر کشت گرفت. سپس از انتهای پرگنه هر زیرکشت، دوباره زیر کشت انجام داد و نهایتاً کشت های حاصله را  با هم مقایسه کرد حتی میتوان بین کشتهای چند اسپوری  یک نژاد که هر کدام از نقش اسپورهای متفاوت گرفته شده است، گزینش انجام داد. برخی از محققین معتقدند که برای بهنژادی نژادهای موجود در یک کشور، بهترین روش استفاده از گزینش چند اسپوری است.