محیط کشت های مورد استفاده برای قارچ های خوراکی

نقطه شروع برای کشت انواع قارچ‌های خوراکی، تهیه محیط کشت مخصوص رشد آن‌ها است (معمولا در لوله آزمایش و پتری دیش). به‌طورکلی، هرگونه بستر مایع یا جامدی که برای رشد، نگهداری و یا انتقال میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شود را اصطلاحاً محیط کشت می‌نامند. محیط کشت می‌تواند با استفاده از مواد سفت‌کننده مانند آرگار یا ژلاتین به صورت جامد تهیه شود. در این شکل صورت می‌گیرد و میکرو ارگانیسم‌ها بهتر در سطح محیط کشت استقرار پیدا می‌کنند.

تهیه محیط کشت

میسلیوم قارچ برای رشد نیاز به غذا دارد. به عبارت دیگر، میسلیوم قارچ نیاز به محیطی دارد که از آن تغذیه کند. آگار- آگار (گرفته شده از یک نوع علف دریایی) تقریباً حاوی هیچ ماده غذایی نیست ، بلکه وقتی با آب مخلوط شود و به عنوان یک ماده ژلاتینی عمل می‌کند، به‌طوری که یک سطح صاف و جامد ایجاد کرده تا میسیلیوم قارچ بتواند روی آن رشد کند. ترکیبی از آگار- آگار آب و یک یا چند ماده غذایی، محیط مناسبی برای رشد میسلیوم سالم ایجاد خواهند کرد. آگار- آگار با درجات متفاوتی در بازار موجود است؛ از جمله می‌توان به آگار مخصوص پخت و پز و آگار با درجه خلوص بالاتر برای تهیه محیط کشت اشاره نمود.

در صورت امکان، بهتر است ازآگاری درجه خلوص بالاتر استفاده شود، چون ناخالصی کمتری دارد و نسبت به آگار مخصوص غذا و شیرینی پزی، ژل‌های با خصوصیات بهتر تولید می‌کند. آگار- آگار در بازار به صورت پودر عرضه می‌شود. از منابع غذایی متفاوتی در محیط آگار- آگار می‌توان استفاده کرد، اما عمومی‌ترین فرمول مورد استفاده عصاره مالت آگار (Malt Extract Agar ) است. علاوه بر این، محیط های آماده استفاده حاوی آگار را می‌توان از فروشگاه‌های مواد آزمایشگاهی خریداری کرد. در این صورت، فقط بایستی به آن آب اضافه نمود.

۱ . محیط کشت سابوراد آگار ( Sabouraud Agar )

محیط کشت سابوراد آگار، محیطی استاندارد برای ارزیابی و نگهداری دامنه وسیعی از جدایه‌های قارچی است. این محیط کشت محتوی آنتی بیوتیک جنتامایسین (Gentamicin)  یا PH  پایین است. اسیدیته پایین در این محیط کشت باعث محدودیت در رشد اکثر باکتری‌ها می‌شود و به صورت اختصاصی به دلیل دارا بودن آنتی بیوتیک جنتامایسین از رشد باکتری های گرم منفی جلوگیری به عمل می‌آورد.

محیط کشت سابوراد آگار را می‌توان در بسته بندی‌های تجاری و یا به وسیله فرمولاسیون زیر تهیه کرد:

برای تهیه یک لیتر از محیط کشت سابوراد آگار مواد زیر با مقادیر مذکور لازم است:

پپتون ( Pepton )    gr 10

گلوکز (Glucose)     gr 40

آگار                     gr 15

تمام ترکیبات محیط کشت را در 900 میلی لیتر آب مقطر دیونیزه حل کنید .

PH محیط کشت را به وسیله اسیدکلریدریک در 2/0 +/6 -5 تنظیم کنید و حجم نهایی ان را به یک لیتر برسانید. محیط کشت را در دمای ^oC  121 و فشار 5/1 اتمسفر اتوکلاو کنید. پس از خنک شدن به دمای ^oC  50 – 45، محیط کشت‌ها را درون پتری دیش‌ها و یا لوله‌های کشت استریل منتقل کنید .

در سابوراد آگار برای محدود نمودن رشد باکتری‌ها معمولاً از آنتی بیوتیک‌های جنتامایسین و یا کلرامفنیکل (Chloramphenicol) استفاده می‌شود .آنتی بیوتیک جنتامایسین از رشد باکتری‌های گرم منفی جلوگیری می‌کند. مقدار استفاده از کلرامفنیکل و جنتامایسین در این‌جا، mg/L 50 است. این آنتی بیوتیک‌ها قبل از استفاده و اضافه شدن به محیط بایستی ml 10 اناتول 95% حل گردند. باید توجه داشت که آنتی بیوتیک‌ها قابل اتوکلاو نیستند و بایستی پس از اتوکلاو کردن محیط و پایین آمدن دمای آن به ^oC 50 – 45 با عبور دادن از فیلتر مناسب و استریل شدن به محیط کشت اضافه گردند.

2 . محیط کشت MEA (Malt Extract Agar )

محیط کشت MEA، محیط جامد مناسبی برای کشت و نگهداری طیف گسترده‌ای از مخمرها و قارچ ها است. این نوع محیط برای جداسازی و شمارش قارچ‌ها و مخمرها در نمونه‌های بالینی، موادغذایی و لوازم آرایشی توصیه می‌شود. در محیط MEA از قند مالتوز به عنوان منبع انرژی استفاده می‌شود. دکسترین یک پلی ساکارید مشتق شده از نشاسته خالص است که به همراه گلیسرول به عنوان منابع کربن در این محیط کشت استفاده می‌شود، پپتون موجود در ترکیبات این محیط کشت به عنوان تأمین کننده منبع نیتروژن محسوب می‌شود. PH اسیدی محیط کشت MEA اجازه رشد به قارچ ها و مخمرها را می‌دهد ،اما از رشد باکتری ها جلوگیری به عمل می‌آورد.
برای تهیه یک لیتر از محیط کشت Malt Extract Agar از مواد زیر با مقادیر مذکور استفاده می‌شود .

مالتوز   (Maltose)              gr75/12

پپتون   (Peptone)             gr 78/0

دکسترین (Dextrin)           gr 75/2

گلیسرول (Glycerol)         gr35/2

آگار                               gr15

ترکیبات محیط MEA را در 900 میلی لیتر آب مقطر دیونیزه حل کنید .

PH محیط را در 2/0 +-6/4 تنظیم کنید و حجم نهایی آن را به یک لیتر برسانید .

پس از خنک شدن محیط کشت به دمای ^oC  121 و فشار 5/1 آتمسفر اتوکلاو کنید .

پس از خنک شدن محیط کشت به دمای ^oC  50 – 45، آن را درون پتری دیش‌های استریل منتقل کنید .

محیط کشت MEA با استفاده از دستورالعمل‌های دیگری نیز تهیه می‌شود. در ذیل دستورالعمل کاربردی دیگری برای تهیه محیط کشت MEA آورده شده است .

برای تهیه یک لیتر از محیط کشت Malt Extract Agar می‌توانید ازمواد زیر با مقادیر مذکور استفاده کنید .

عصاره مالت (Malt Extract)               gr  30

پپتون ( peptone Mycological )    gr 5

آگار                                          gr 15

Ph نهایی در 4/5 تنظیم گردد .

درصورت تمایل می توان برای افزایش مواد غذایی محیط کشت، به آن gr  2 عصاره مخمر اضافه نمود. در این صورت، به آن محیط کشت MEYA گفته می‌شود.

3 . محیط کشت  (Potato Dextrose  Agar) PDA

محیط کشت PDA، یک محیط کشت غیرانتخابی برای رشد انواع قارچ ها و مخمرها است . این محیط کشت توسط انجمن بهداش عمومی آمریکا (APHA) برای شمارش قارچ‌ها و مخمرها در آزمون‌های محصولات غذایی و لبنی توصیه شده است. دکستروز موجود در این محیط کشت، یک کربوهیدرات قابل تخمیر است که به عنوان منبع کربن و انرژی در این محیط کشت استفاده می‌شود .

برای تهیه یک لیتر از محیط کشت (PDA) Potato Dextrose مواد و مقادیر لازم به قرار ذیل است:

سیب زمینی پوست کنده و خردشده               gr 200

دکستروز (Dextrose)                                gr  20

آگار                                                      gr   15

سیب زمینی‌های خردشده را در یک لیتر آب مقطر به مدت یک ساعت بجوشانید و سپس با استفاده از یک صافی عصاره آن را جدا کنید .

عصاره عبور داده شده را با gr20 دکستروز ترکیب نموده  به حجم ml 90 برسانید .

Ph محیط کشت را در 2/0 +- 6/5 تنظیم نمایید .

در انتها حجم کل محیط کشت را به یک لیتر رسانده و آگار را به آن اضافه نمایید .

به مدت 20 دقیقه محیط کشت را اتوکلاو نمایید و

پس از رسیدن دمای محیط کشت به ^oC  50 – 45، آن را به درون پتری دیش‌ها منتقل کنید .

همچنین مشابه محیط کشت MEA، می‌توان محیط کشت PDA را با عصاره مخمر غنی‌تر نمود‌. در این صورت، به آن محیط کشت PDYA می‌گویند .

استریل نمودن و توزیع محیط کشت به ظروف

برای این که به یک اتوکلاو، یک استوانه مدرج و فلاسک پیرکس یک لیتری احتیاج است. به جای اتوکلاو از یک زودپز خانگی هم می‌توان استفاده نمود. اما زودپز وقتی سردشود، خلأ ایجاد نمی‌کند ( یعنی در اثر سردشدن به داخل خودش هوای آلوده را می‌کشد) بنابراین بایستی برای سردشدن در محیط استریل قرار گیرد. در صورت ممکن، استفاده از اتوکلا و آزمایشگاهی صنعتی استاندارد پیشنهاد می‌شود. برای توزیع محیط استریل به ظروف، به مقداری الکل و دستمال کاغذی یا پنبه نیاز است. مراحل کار عبارت اند از :

1 . ترکیبات لازم را وزن کنید، مقدار مناسبی آب به آن بیفزایید (ترجیحاً آب بدون کلرو استریل) و در فلاسک آنها را مخلوط کنید .

2 . از پنبه‌هایی که آب جذب نمی‌کنند و یا ورقه های فویل آلومینیومی برای بستن درب فلاسک استفاده کنید. درب فلاسک را خیلی محکم نکنید ، چون فشار ایجاد شده‌ی داخل فلاسک در زمان استریل کردن، سبب پرت شدن آن خواهد شد و محیط غذایی به شدت جوش می‌آید .

3 . اتوکلاو را به اندازه کافی آب کنید، برای استفاده از حجم مناسب آب به دستورالعمل سازنده آن توجه کنید.

4 . فلاسک‌ها را در اتوکلاو قرار دهید. اگر از پتری دیش ها قابل اتوکلاو استفاده می‌کنید، آنها را نیز هم‌‌زمان باید در اتوکلاو استریل نمایید. چنانچه از پتری دیش‌های یک بار مصرف استفاده می‌کنید، به دلیل اینکه قبلاً استریل شده اند، احتیاج به استریل شدن مجدد ندارند. برای آلوده نشدن، پلاستیک بسته بندی آن‌ها بایستی فقط در زیر هود استریل باز شود .

5 . اتوکلاو را برای درجه حرارت ^oC  21 و فشار 5/1 آتمسفر تنظیم کنید و زمان اتوکلاو را از زمان رسیدن به مقادیر فوق، 20 – 15  دقیقه درنظر بگیرید. سعی شود که در تمام مدت اتوکلاو نمودن، فشار و درجه حرارت اتوکلاو ثابت بماند در غیر این صورت محیط به طرز مطلوبی استریل نخواهد شد .

6 . پس از اتمام زمان استریلیزاسیون، اجازه دهید فشار اتوکلاو خودبه خود به صفر برسد .

7 . برای توزیع محیط غذایی به ظروف، دوش بگیرید و لباس های تازه شسته بپوشید. این مراقبت‌ها باعث کاهش آلودگی می‌شود. باکتری‌ها و قارچ‌هایی که به دست‌ها و لباس‌ها می‌چسبند می‌توانند ظروف را آلوده نمایند. بهتر است در صورت امکان از لباسهایی استفاده کنید که بعد از شستشو در معرض هوای بیرون قرار نگرفته باشند. موهای سر حامل باکتری‌ها و قارچ‌ها هستند . بهتر است آن‌ها را پس از شستن به پشت گره بزنید (خانم ها) و یا از کلاه‌های مخصوص (جراحی و پرستاری) استفاده کنید .

۸ . در مدت زمانی که محیط آگار قبل از توضیح جامد شود، سطح جلویی کابینت و هود لامینار ایرفلو (شکل ۱-10) را با الکل تمیز کنید. همچنین دست‌های خود را با الکل تمیز کنید و هرازگاهی این عمل را تکرار نمایید تا زمانی که کار در زیر هود استریل تمام شود، ابتدا پتری دیش‌هایی که به فیلتر هود استریل نزدیک‌ترند را پر کنید. هوای تمیزی که از سمت فیلتر به سمت شما در جریان است ، باکتری‌ها ، قطعات پوست و غیره را که بر روی دست‌ها و لباس‌های شما قرار دارد، از پتری دیش‌ها دور می‌کند. قدرت‌های خود را بین فیلتر و پتری  دیش های باز قرار ندهید ه به‌عبارت‌دیگر ، هیچگاه دست های خود را از سمت فیلتر هود، جلوتراز پتری‌های باز قرار ندهید. اگر این اتفاق بیفتد هوایی که از سمت فیلتر به سمت صورت شما در جریان است ، آلودگی‌ها را از دست‌ها و آستین‌های شما به سطح محیط کشت منتقل می‌کند.

۹ . درب پتری دیش‌ها را با یک دست بردارید و با دست دیگر محیط غذایی را به داخل آن بریزید. اجازه ندهید دست‌های شما لبه‌های پتری و یا درب آن را لمس کند، چون قطعات پوست به لب‌ها می‌چسبند و آلودگی ایجاد می‌کنند. وقتی درب پتری را برمی‌دارید آن را با زاویه ۴۵ درجه به سمت فیلتر بگیرید به‌طوری که فقط هوای تمیز به داخل آن برخورد کند. در تمام مراحل روی ظرف‌های باز تنفس نکنید چون بازدم انسان حاوی باکتری‌ها است.

۱۰ . وقتی که هر پتری دیش پر شد، اجازه دهید سرد و جامد شود. بیش از زمان لازم دست‌های خود را در هود استریل قرار ندهید، چون دست‌های شما پتانسیل پخش آلودگی را دارند (شکل ۲- ۱۰) .

تلقیح پتری دیش ها

برای استریل نمودن اسکالپل به یک چراغ الکلی یا شعله کوچک گاز نیاز دارید. اگر از پارافیلم برای درز گیری پتری‌ها استفاده کنید ، شانس ایجاد آلودگی کمتر خواهدشد. با این وجود ، اگر پتری دیش‌ها را در جلوی فیلتر هود استریل روشن قرار دهید تا زمانی که توسط میسلیوم کلونیزه شود، درز گیری با پارافیلم لازم نیست.

۱ .نوک اسکالپل را روی شعله بگیرید تا قرمز شود. با فرو بردن آن به مرکز ظرف پتری دیشی که قرار است آنرا تلقیح کنید،اسکالپل را سرد نمایید.

۲ . لوله آزمایش حاوی کشت میسلیوم را بردارید (درب آن قبلاً شل شده باشد) و بدون لمس نمودن لبه‌ها یا داخل آن درب آن را باز کنید. با اسکالپل لایه ای از ۲۰ میسلیوم را بردارید، درب پتری دیش را برداشته و سریع این قطعه را به پتری دیش منتقل نموده و فوراً درب آن را ببندید. این عمل سخت‌تر از آن است که به نظر می‌رسد. اما با تجربه و ممارست مشکل حل خواهد شد. قطعه میسلیوم را در مرکز پتری دیش قرار دهید به طوری که بتواند به صورت شعاعی به اطراف رشد نماید.

۳ . اگر قرار است از پارا فیلم استفاده کنید، فوراً پتری‌هایی که تلقی کرده‌اید را درزگیری نمایید. در غیر این صورت ، بلافاصله آن را از محل کار دور کنید، اما هنوز در جلوی فیلتر هود استریل باشد.

۴ . اعمال فوق را تکرار نمایید تا اینکه میسلیومی در لوله آزمایش نماند. از هر لوله آزمایش برای تلقیح  ۲ تا ۳ پتری دیش می‌توان استفاده کرد.

۵ . پتری دیش‌ها بایستی در ^oc24 و یا نزدیک ترین درجه حرارت به آن نگهداری شوند. مسیلیوم قارچ صدفی معمولاً سریع رشد می‌کند. بعد از دو تا سه روز قطعه منتقل شده خواهید بود. میسلیوم معمولاً سفید رنگ است و اکثر نژادها ، پتری دیش را طی ۱۰ روز پر می‌کند . اگر قسمت‌هایی از پتری با کلونی‌های متفاوتی اشغال شود، به احتمال زیاد این نشانه آلودگی است. شاید کپک سبز- آبی یا لکه‌های لزج زرد درین پتری‌ها مشاهده شود، در این حالت پتری دیش آلوده را بایستی خارج کرد و پس از اتوکلاو کردن به دور ریخت. اگر تمایل به نابود کردن آن ندارید ، سعی کنید قطعه آلوده نشده از میسلیوم قارچ را از پتری دیش آلوده به پتری دیش تمیزی منتقل کنید. هرگز سعی نکنید که قطعه آلوده را از پتری دیش آلوده خارج کنید. چون این کار غالباً به پخش بیشتر  آلودگی می‌انجامد. خصوصاً کپک‌ها میلیون‌ها اسپور تولید می‌کنند. با دستکاری آن‌ها این اسپورها در هوای آزمایشگاه پخش خواهند شد و پتری‌های  تمیز دیگر را آلوده می‌کنند. بنابراین ، تا ممکن است از طریق ریشه‌های آلوده صرف نظر کنید و آن‌ها را بدون اینکه دربشان باز شود، اتوکلاو نمایید سپس پس آن‌ها را به دور بیندازید.

وقتی پتری دیش‌ها کاملاً پر شود، برای سه منظور می‌توان از آن‌ها استفاده کرد:

برای تلقیح پتری دیش های جدید حاوی محیط غذایی آگار؛ برای تهیه محیط کشت از دستورالعمل فوق استفاده کنید، اما به جای استفاده از کشت لوله آزمایش قطعه‌های مربعی شکل به ابعاد تقریبی ml1 از پتری دیش پرشده بردارید و آن را به پتری دیش جدید منتقل کنید. از یک پتری دیش  می‌توان حدود  ۱۵ پتری دیش جدید تلقیح کرد. برای تلقیح لوله های آزمایش حاوی محیط غذایی آگار ، به‌طوری که یک ذخیره از نژاد داشته باشید.
برای تلقیح دانه‌های استریل غلات به منظور تهیه ‏اسپاون .

نگهداری محیط های کشت و نکات لازم

محیط کشت‌های‌ آماده شده بایستی در شرایط خاصی از نظر دما، نور و رطوبت نگهداری شوند. همچنین محیط‌ها باید دارای برچسب شناسایی بوده که در آن تاریخ و نوع مواد موجود در محیط کشت مشخص شده باشد و در محیط آزمایشگاه مکان خاصی به نگهداری آن‌ها اختصاص یابد. شرایط محیطی موثر بر طول عمر محیط های کشت عبارتند از:

نور: به طور کلی، محیط‌های آماده شده و همچنین تمام ترکیبات مورد استفاده در تهیه محیط کشت بایستی به دور از نور مستقیم خورشید نگهداری شوند. حضور نور به مدت طولانی بر خصوصیات و ویژگی‌های ترکیبات محیط کشت اثر می‌گذارد و تاثیر آن‌ها را در آزمایشات تحقیقاتی کاهش می‌دهد.

رطوبت: ظروف پلاستیکی و شیشه ای درب دار کمتر تحت تاثیر رطوبت موجوددر آزمایشگاه قرار می‌گیرند. اما ترکیبات پودری موجود در آن‌ها با باز شدن درب ظرف در مجاورت رطوبت آزمایشگاه قرار می‌گیرند. در این شرایط استفاده از کمدهای نگهداری مواد آزمایشگاهی برای نگهداری مواد توصیه می‌شود.

دما : دمای نگهداری مواد و ترکیبات شیمیایی آزمایشگاهی معمولاً دامنه متنوعی دارد. برای آگاهی از شرایط  نگهداری و وضعیت دمایی مناسب به دستورالعمل شرکت سازنده ماده شیمیایی باید مراجعه شود. اما در رابطه با محیط‌های کشت تهیه شده، دمای مناسب برای نگهداری محیط های جامد  ^oc 25- 15 و برای محیط‌های مایع ^oc 8 – 2 است. عمر مفید محیط‌های کشت جامد در شرایط مناسب 9 – 6 ماه و این زمان برای محیط‌های کشت مایع 12 – 6 ماه است .

 

کتاب پرورش واصلاح قارچ خوراکی صدفی- ص 112 الی 119