آکادمی قارچآموزش

آشنایی کامل با مراحل کشت اسپور + [راهنما مرحله به مرحله]

یکی از اصلی ترین روش های انتخاب درون نژادی، استفاده از کشت اسپور است. این امر براساس نه تنوعی است که بازیدیوسپورها با یکدیگر نشان می دهند.

در اینجا باید توجه داشت که تک اسپورهایبا منشاء هتروکاریوتیک با تک اسپورهای با منشأ هموکاریوتیک به دلیل وضعیت پلوئیدی خود ممکن است تفاوت رشدی نشان دهند، اما سؤال این است که منشأ تنوع درون تک اسپورهای هتروکاریوتیک چه می تواند باشد؟

همان طور که گفته شد، به دلیل اینکه دو هسته غیرخواهری به درون یک بازیدیوسپور مهاجرت می کنند، قاعدتا تمامی اسپورهای تولیدی در اکثر مکانهای ژنی، شبیه والد خود و هتروزایگوس خواهند شد و ظاهرا نبایستی تنوعی مشاهده شود. اما در اینجا پدیده هایی که در ارتباط با تقسیم میوز رخ می دهند ممکن است باعث ایجاد تنوع شوند.

اولا ممکن است در هنگام قسیم میوز تو به وجود آمدن هسته ها، در برخی مکانهای ژنی دور از سانترومر، به طور تصادفی کراسینگ آور رخ دهد و در نتیجه هنگامی که دو هسته غیر خواهری به درون یک بازیدیوسپور مهاجرت می کنند، در برخی از مکانهای ژنی خود دچار باز ترکیبی و یا حتی هموزایگوسیتی شوند.

همچنین ممکن است هنگامی که دو هسته مشابه خواهری به درون یک بازیدیوسپور مهاجرت می کنند (همو کاریون غیر حقیقی، فصل ۲)، در اثر کراسینگ آور مقداری هتروزایگوسیتی در برخی مکانهای ژنی به وجود آید.

همین امر یکی از راههای شناخت این نوع همو کاریونها از هموکاریونهای حقیقی که از بازیدیوسپورهای با یک هسته میوزی به وجود آمده اند و امکان بازترکیبی و هتروزایگوسیتی در مکانهای ژنی را ندارند، می باشد.

نتیجه نهایی آنکه درصدی از نتاج هتروکاریوتیک معادل نصف احتمال وقوع کیاسما، باز ترکیب خواهند شد.

دوم آنکه برخی آللها ممکن است با پروموتورهای جدید یا نواحی تنظیمی سیس- اکتینگ ( Cis-  acting ) در ارتباط باشند و بالاخره آنکه پدیده باز آرایی ( Re – assortment ) کروموزوم ها در هسته های هاپلوئید جدید، ممکن است محیط تنظیمی جدیدی برای برخی ژنها ایجاد نماید.

این مکانیسم ها به ویژه می تواند صفات با کنترل ژنتیکی از جمله سرعت رشد میسلیوم که یک صفت کمی محسوب می شود، را تحت تأثیر قرار دهد (پرفسور کریگن، مرکز تحقیقات سیلون آمریکا، مکاتبات شخصی، 1995 ,.Khush et  . al ).

بخش مهم دیگری از این تفاوت مربوط به تنوعی است که تحت عنوان انواع شکل پرگنه شناخته می شوند. در همین جا است که بحث ناهنجاری های رشدی ژنتیکی (پایدار) و غیر ژنتیکی (ناپایدار) مطرح میشود.

انواع شکل پرگنه بیشتر به رشد طبیعی یا منحرف شده (ناهنجار) هيفها مرتبط می شود. ناهنجاریهای رشدی ژنتیکی یعنی آنکه تفاوت هيف ناهنجار با هیف طبیعی ذاتی است و به ارث می رسد.

ناهنجاریهای غیر ژنتیکی در اثر محیط کشت و دفعات زیر کشت و نگهداری طولانی مدت ایجاد می شود و ممکن است به پس روی نژادی منجر شود که در فصل ۳ نیز بدان اشاره شد.

البته این تنوعات بعدا ممکن است حتی به ارث هم برسند (1994 ,.Li et . al و 1995 ,.Heath et al). در هر حال، اساس ژنتیکی و نحوه عمل انواع شکل پر گنه هنوز کاملا مشخص نیست.

با توجه به مجموع این مکانیسم ها، می توان انتظار داشت که کشت های تک اسپوری یا قسمتهای مختلف یک کشت چنداسپوری تا حدودی با یکدیگر تفاوت نشان دهند.

هنگامی که هدف از یک برنامه اصلاحی، انتخاب درون نژادی به ویژه بازیابی عملکرد یک نژاد باشد، استفاده از این تفاوتها سودمند است. اما این روش فقط باعث کشف و حفظ بازترکیبیها (یا پتانسیل باز ترکیب پذیری در درون یک نژاد میشود.

برای استفاده از پتانسیل ژنتیکی چند نژاد باید روش های دیگری مورداستفاده قرار گیرند که در ادامه این فصل به آنها اشاره می شود.

 تهیه نقش اسپور

برای انجام کشت های تک و چنداسپوری، ابتدا باید نقش اسپور (Spore print) تهیه شود. برای تهیه نقش اسبور ابتدا یک عدد قارچ متوسط تازه قبل از اینکه پرده زیر کلاهک باز شده باشد، انتخاب می شود.

قسمت پایه قارچ قطع و کلاهک قارچ تمیز می شود. سپس پرده زیر کلاهک با چاقوی جراحی سترون حذف و کلاهک به یک ظرف پتری بر روی یک کاغذ صافی ضدعفونی شده منتقل می شود.

مجموعه حاضر به وسیله یک ظرف مناسب سترون مثلا یک بشر پوشانده می شود. معمولا بعد از ۷۲-۴۸ ساعت، نقش اسپور در کاغذ صافی تشکیل می شود.

کاغذ صافی حاوی نقش اسپور را می توان به نوارهای باریکی تقسیم و این نوارها را در لوله های ۱۸ میلی لیتری در محیطی خشک و سرد (حداکثر ۴°C) حتی تا یک سال نگهداری کرد (شکل ۲-۶).

 مکانیسم تندش بازیدیوسپورها

به منظور تندش بازیدیوسپورها، باید یک مایع تعلیقی از اسپورها تهیه کرد. این مایع تعلیقی ابتدا به صورت خیلی غلیظ تهيه و سپس برای رقت مناسب آماده می شود.

برای تنظیم رقت مناسب اسپورها، از یک لام گلبولشمار استفاده میشود. در طی تحقیقات نسبتا زیادی که در دو دهه اخیر انجام شده است، رقت های مختلفی برای تضمین موفقیت کشت اسپور، گزارش شده است.

اما آنچه که رایج است و بیشتر مورد اطمینان می باشد آن است که با استفاده از لام گلبول شمار، رقت ۱۰۰ اسپوربر میلی لیتر تهیه و برای کشت در هر ظرف پتری، ۲۸۱۰۴ اسپور از آن برداشته می شود.

در تمام این مراحل باید حداکثر سعی را به کار برد تا از هرگونه آلودگی اجتناب شود، چرا که کشت اسپور به آلودگی به ویژه آلودگی باکتریایی بسیار حساس است(Horgen et. al., 1989).

اصولا، بازیدیوسپورها به دو گروه تقسیم می شوند:

(الف) گروه اول که تعداد آنها بسیار کم است (در حدود ۵٪ کل بازیدیوسپورها)، در حقیقت،  تندش کننده های اولیه هستند و بدون تحریک خارجی و فقط با وجود رطوبت و محیط غذایی کافی تندش می کنند.

این گروه از بازیدیوسپورها از نوع اسپورهای با خواب برونزادی (Exogenously dormant spores) هستند. برای آنکه تعداد تندش کننده های اولیه در یک کشت اسپور به اندازه ی کافی زیاد باشد، باید تراکم بازیدیوسپورها برای جدا کردن تک اسپورها مناسب باشد و همچنین مقدار حجم مایع تعلیقی با سطح ظرف پتری متناسب باشد.

لذا باید رفت مایع تعلیقی اسپورها  در حدود ۲۶۱۰ اسپور برای هر ظرف پتری معمولی با قطر ۱۰cm باشد.

(ب) گروه دوم بازیدیوسپورها آنهایی هستند که اصطلاحا تندش کننده های تأخیری نامیده می شوند. این دسته  از بازیدیوسپورها برای تندش علاوه بر رطوبت و محیط کشت کافی، نیاز به یک عامل تحریک کننده دارند. در واقع، این بازیدیوسپورها دارای خواب ساختمانی (Constitutively dormant spores) هستند.

برای تحریک تندش این دسته از بازیدیوسپورها، می توان یک پرگنه یک هفته ای (به قطر ۱  – ۲cm) از کشت بافت قارچ تکمه ای سفید را در محیط کشت اسپور قرار داد. این کشت یک هفته ای از میسلیوم می تواند به دلایلی، بازیدیوسپورهای تأخیری را تحریک به تندش کند.

یکی از نظریاتی که در این ارتباط بیان شده آن است که در قطعه میسلیوم تحریک کننده یک ماده فرار به نام ایزووالرات (Isovalerate) وجود دارد که می تواند CO را که ممانعت کننده تندش است، حذف نماید. غلظت پایین CO یکی از ملزومات تندش است.

کشت تحریکی به این شیوه در کشت اسپور قارچ Volvariella bombycina نیز کاربرد دارد (1989 ,.Horgen et  . al ). همان طور که ذکر شد، یکی از مشکلات عمده محققین اصلاح این قارچ، وجود آلودگی باکتریایی در کشتهای اسپور می باشد.

آلودگی باکتریایی می تواند از طریق رعایت بهداشت در جمع آوری اسپورها، نگهداری در شرایط بهداشتی، تنظیم صحیح رقت کشت اسپور و استفاده از استروپتومایسین به میزان ۲۵ میکروگرم بر میلی لیتر برطرف شود.

نگهداری کشت های اسپور در درجه حرارت مناسب بسیار حائز اهمیت است. درجه حرارت های بالاتر از ۲۵°C باعث می شود که خطر از بین رفتن اسپورها افزایش یابد و درجه حرارت های کمتر از ۲۰°C باعث میشود که دمای لازم برای تندش اسپورها فراهم نشود.

در طی تحقیقات مختلف ثابت شده است که بهترین دما برای تندش مطلوب بازیدیوسپورها ۲۵°C است (شکل ۳-۶). مکانیسم تندش بازیدیوسپورها نکات بسیار زیادتری دارد که از حوصله این کتاب خارج است. پس از کشت اسپور، گزینش تک یا چنداسپوری انجام می شود.

 گزینش تک اسپوری

با توجه به روشی که در کشت اسپور گفته شد، از ۱۲-۵ روز بعد از کشت اسپور، می توان منتظر تندش بازیدیوسپورها بود.

ابتدا هر کدام از بازیدیوسپورهای تندش کرده ( که لوله تندش آنها با میکروسکوپ و  پر گنه آنها با چشم غیر مسلح قابل رؤیت باشد) به یک ظرف پتری حاوی محیط کشت مناسب منتقل می شود.

تقریبا بعد از گذشت ۲۵-۲۰ روز، میسلیوم این تک اسپور بیشتر سطح ظرف پتری را اشغال می کند.

اگر از کشتهای تک اسپور به اندازه کافی در اختیار باشد، می توان تنوع مورفولوژیکی محسوسی را در بین آنها مشاهده کرد. مرحله ۱ گزینش تک اسپوری نیز براساس همین تنوع است.

منشأ این تنوع در بخش ۳-۲ توضیح داده شده است. این تفاوت های مورفولوژیکی باعث ایجاد تیپ های رشدی مختلف می شود. هر تیپ رشدی خود از دو جزء مهم، شکل پرگنه و سرعت رشد میسلیوم تشکیل یافته است.

از نظر شکل پرگنه، می توان انواع رشته ای (Strandy)، کرکی (Fluffy)، پنبه ای (Cottony) و بدون میسلیوم هوایی (Appressed) را مشاهده کرد.

از نظر سرعت رشد نیز می توان انواع سریع، متوسط، کند و بسیار کند را در کشت های تک اسپور تشخیص داد. در جایی که هدف از انتخاب درون نژادی، بهبود عملکرد یک نژاد باشد، باید کشت های تک اسپوری را که تیپ رشدی آنها از نوع رشته ای و سریع است، انتخاب و از آنها بذر تهیه کرد.

می توان مشابه همین گزینش را نیز در مرحله اسپاون برای انواع اسپاونهای مربوط به کشت های تک اسپور انجام داد. اسپاون های انتخابی در آزمایشات میوه دهی در حجم کم و در نهایت در آزمایشات میوه دهی تکراردار در حجم زیاد جهت ارزیابی دقیق مورداستفاده قرار می گیرند (گردان و فارسی، ۱۳۸۳).

اما در جایی که هدف، انتخاب انواع ویژه ای از تک اسپورها باشد، به نحوی که بتوان از آنها 2 برنامه های هیبریداسیون برون نژادی استفاده کرد، نحوه دیگری از گزینش باید انجام شود که در بخس بعدی تشریح خواهند شد.

شکل ۴-۶ نشان دهنده تنوعی است که ممکن است در کشت های تک اسپوری به نژاد دیده شوند.

 

گزینش چنداسپوری

گزینش چنداسپوری یکی از قدیمی ترین و ساده ترین روش های گزینش برای قارچ تکمه ای است. برای گزینش چنداسپوری می توان به همان روشی که قبلا گفته شد، کشت اسپور انجام داده و سپس اجازه داد تا سطح ظرف پتری توسط میسلیوم های ناشی از تندش اسپورها اشغال شود.

۲۰-۱۴ روز بعد، هر کشت چنداسپوری انواع مختلفی از تیپ های رشد را نشان میدهد.

لذا از نواحی مختلف هر کشت، می توان زیر کشت گرفت. سپس از انتهای پرگنه هر زیر کشت، دوباره زیر کشت انجام داد و درنهایت کشت های حاصله را با هم مقایسه کرد. حتی می توان بین کشت های چنداسپوری یک نژاد که هر کدام از نقش اسپورهای متفاوت گرفته شده است، گزینش انجام داد.

برخی از محققین معتقدند که برای به نژادی نژادهای موجود در یک کشور، بهترین روش استفاده از گزینش چنداسپوری است (1994 ,Mehta and Bhandal).

 

اشنایی با بخش دوم کشت اسپور
اشنایی با بخش دوم کشت اسپور

با تهیه‌ هاگ های سالم به روش‌های ساده می‌توان به یک نژاد نسبتاً سالم دست یافت. در صورت جوانی زنی توده هاگ، نژادهای متنوعی ایجاد می‌شوند که گاهی ممکن است با یکدیگر سازگاری نداشته و هر یک از آن‌ها در شرایط مصنوعی آزمایشگاهی به لحاظ روش و مقدار محصول تفاوت زیادی باهمداشته باشند.

کشت هاگ که که در حقیقت ‌نوعی تکثیر جنسی است دارای کیفیت و کمیت متنوعی بوده که از آن می توان برای تولید بذر قارچ استفاده کرد.

روش دوم  تولید بذر، کشت بافت نام دارد که در حقیقت نوعی تکثیر غیرجنسی است، که به علت شباهت بالای محصول تولیدی با والدین خود، بیشتر در تکثیر قارچ‌هایی که از نظر کیفیت و محصول در حد مطلوبی هستند استفاده می‌شود.

پرورش‌دهندگان قارچ، کشت هاگ را به دلیل آسانی استفاده، تشکیل و  ماندگاری بالا در دستور کار خود قرار می‌دهند.

تهیه هاگ سالم

مرحله اول کشت هاگ جمع‌آوری هاگ سالم از قارچ های سالم است. برای این کار کلاهک سالم، تازه و تمیزی را از ساقه جدا کرده و به‌طور واژگون روی یک کاغذ سفید و سطح شیشه‌ای حدود دو ساعت قرار می‌دهیم.

اگر کلاهک خشک باشد، جهت رهاسازی آسان‌تر هاگ یک یا دو قطره آب مقطر به‌منظور جلوگیری از کاهش تبخیر به  کلاهک قارچ اضافه می‌کنیم و یک بشر روی آن قرار می‌دهیم.

بعد از چند ساعت که هاگ‌ها کاملاً  از کلاهک رها شدند و نقش تیغه کلاهک روی کاغذ خواهد افتاد، کاغذ هاگ‌ها را بریده و از وسط تا می‌زنیم و دریک ظرف در بسته قرار داده و روی آن برچسبی حاوی زمان جمع‌آوری، گونه قارچ و شماره جمع‌آوری می‌زنیم.

در صورتی که از لامل برای جمع آوری هاگ استفاده شده باشد، هاگ ها را مابین دو لامل قرار داده دورتادور لبه‌ی این دو لامل را با نوارچسب می‌چسبانیم تا از نفوذ هاگ‌های آلاینده جلوگیری کنیم.

در صورت عدم رعایت این نکات محیط کشت آلوده‌شده و امکان عمل‌آوری یک توده هاگ خالص کاهش می‌یابد.

در بخش زیرین قارچ‌های دکمه‌ای یک غشاء نازک به نام پرده وجود دارد که از لبه‌ی کلاهک تا پایه قارچ کشیده شده و از هاگ‌ها در برابر شرایط نامساعد محیطی و آلاینده‌ها حفاظت می‌کند.

هنگام انتخاب نمونه، قارچ‌هایی باید انتخاب شود که پرده آن‌ها هنوز پاره نشده باشد تا با برداشتن دقیق و استریل این پرده به هاگ‌های خاص‌تری دست پیدا کرد.

تکنیک‌های جوانه‌زنی هاگ

پس از تهیه هاگ لازم و مطلوب می‌توان شروع به کشت کرد. در ابتدا حلقه‌ی تلقیح یا تیغ جراحی را با حرارت شعله به مدت ۱۰ ثانیه استریل کرده سپس آن را داخل یک پتری دیش حاوی محیط کشت استریل فروکرده و اجازه می‌دهیم تا خنک شود.

سپس به‌ وسیله‌ی آن‌ها هاگ‌ها را کم‌کم از روی کاغذ برداشته و به‌صورت خط‌خطی یا زیگزاگ بر روی سطح آگار پخش می‌کنیم برای این‌که جوانه‌ زنی هاگ‌ها بهتر باشد می‌توان به‌طور همزمان ۳ پتری دیش را باهم تلقیح کنیم که به این روش کشت چندگانه یا توده‌ای هاگ می‌گویند.

جذب رطوبت

با گذشت زمان از لحظه تلقیح، هاگ‌ها رطوبت را محیط کشت جذب کرده و متورم می‌شوند .اگر در این مرحله رطوبت به‌ اندازه کافی به هاگ‌ها نرسد، هاگ ها چروکیده شده و به‌راحتی جوانه نخواهند زد.

برای برطرف نمودن کاستی رطوبت می‌توان با مرطوب کردن هاگ‌ها و پتری با آب استریل، جوانه‌زنی آن‌ها را بهبود بخشید. برای مرطوب کردن آن‌ها می‌توان از قطره‌چکان نیز  استفاده کرد.

با قرار دادن پتری ها بصورت وارونه در محیط و دمای 20-25 درجه و انتظار شرایط برای جوانه زنی هاگ ها مهیا خواهد شد.

۳ الی ۷ روز بعد از تلقیح هاگ جوانه می‌زند و به‌صورت رشته‌های سلولی نخ مانند به نام هیف منشعب از یک نقطه‌ی مرکزی در سطح محیط کشت ظاهر می‌شوند و به‌سرعت با گسترش این رشته‌ها و در هم رفتن آن‌ها، شبکه میسلیومی به وجود می‌آید که در ابتدا به‌ صورت غیر مستقیم و به رنگ خاکستری بوده و بعد از مدت کمی با تقسیم و تکثیر هبف های بیشتر آن‌ها در محیط کشت به رنگ سفید درمی‌آیند.

 میسلیوم ها

رنگ میسلیوم  قارچ دکمه ای ، شی تاکه، قارچ رقیب کلاهدار، پانالوس و سیلوسب خاکستری مایل به سفید است و در گونه‌های همچون Iepista nuda آبی مایل به ارغوانی و گونه‌ای خاص از سیلوسب قهوه‌ای است. درمجموع تنوع رنگ تابع نژاد قارچ، روش تکثیر و محیط رشد است.

از خصوصیات ظاهری میسلیوم ها می‌توان به نوع رویش آن اشاره کرد که از این نظر که به انواع هوایی، مسطح، پنبه، یا ریشه‌ای شکل می‌شود.

میسلیوم هوایی در گونه‌هایی که در نواحی مرطوب رشد می کنند،دیده می‌شود. میسلیوم مسطح، بیشتر در شرایط خشک دیده می‌شود.

مراقبت از محیط کشت

با توجه به این‌که بسیاری از آلودگی‌های متداول، ناشی از کپک‌های هاگ‌زا هستند. باید مراقب بود تا محیط کشت را تکان نداده و یا کاری نکرد که باعث انتشار هاگ‌های این قبیل قارچ‌ها شود و همچنین باید از خنک بودن تیغ جراحی قبل از ورود آن به داخل محیط آگار اطمینان حاصل کرد، زیرا یک تیغ و یا هرگونه وسیله داغ که به داخل آگار وارد می‌شود، باعث تولید بخار ناگهانی درون پتری دیش می‌شود و درنتیجه موجب رهاسازی هاگ کپک‌های مجاور می‌گردد.

در صورت ایجاد یک ترکیب غیر یک دست ژنتیکی، کل عملکرد محصول دچار اسیب های جبران ناپذیری خواهد شد.  در این توده غیر یکنواخت ژنتیکی نژادهای کم بازده مانع فعالیت نژادهای پربازده خواهند شد و.

از بین تعداد کثیری از نژادهای ایجادشده در کشت توده‌ای هاگ، ممکن است تنها اندکی از آن‌ها قادر به جذب مواد غذایی و آب خواهند بود اما توانایی تولید اندام باردهی یا کلاهک را ندارند.

مونوکاریون و هتروکاریون

به شبکه سلولی حاصل از یک هاگ که عموماً هاپلوئید و دارای یک هسته هستند مونوکاریون گفته می شود. این میسیلیوم ها فاقد توانایی باروری هستند.از برخورد دو مونوکاریون سازگار باهم، مواد سلولی و ژنتیکی آن‌ها باهم مبادله شده و یک میسلیوم دو هسته ایجاد می‌شود که قادر به باروری است.

چنین اتفاقی در هر مرحله‌ای از تولید اتفاق می‌افتد. تلاقی نژادهای خویشاوندی قارچ‌ها باهم، مشابه ایجاد گیاهان دو رگه در باغبانی است.

ایجاد ایزوله‌ها

روش دیگر کشت هاگ، ایجاد ایزوله‌های یک هاگ و رقیق‌سازی هاگ‌ها با کمی آب مقطر است. محلول هاگ حاصل را می‌توان با انتقال آن به ظرف حاوی آب مقطر بیشتری، رقیق کرد که به ‌نوبه خود از آن می‌توان برای تلقیح نهایی در ظروف کشت استفاده کرد.

پرورش‌دهنده با این روش می‌تواند هر یک از میسلیوم های جوان تک‌هسته‌ای را دیده و یک زمان‌بندی برای تلاقی جهت توسعه نژادهای پربازده ایجاد کنید.

با توجه به شرایط محیطی و تازگی و سلامت هاگ هااز هر ۱۰۰ گرم هاگ، عموماً ۱ تا ۵ عدد هاگ جوانه می‌زنند.

خطرات تهدیدکننده اسپورها

از بزرگ‌ترین خطراتی که متوجه کشت‌های توده اسپوری است، افزایش مقدار آلودگی به‌ویژه آلودگی باکتریایی است. امکان بیماری و آلودگی برخی از نژادهای خویشاوند وجود دارد که در صورت جوانه‌زنی توده‌ای آن‌ها احتمال پخش آلودگی در محیط زیاد می‌شود.

بسیاری از قارچ‌ها دارای یک رابطه همزیستی مناسبی با دیگر موجودات هستند. مثلاً باکتری‌ها و مخمرها قادر هستند جوانه‌زنی هاگ‌ هایی که در شرایط استریل و به‌تنهایی بسیار مشکل انجام می‌شوند را تسهیل نمایند.

با اضافه شدن عمدی یا اتفاقی برخی باکتری‌های خاص به تعدادی از محیط‌های کشت، می‌توان رشد و نمو آن‌ها را تشدید کرد.

کشت بافت

کشت بافت، روشی قابل‌اطمینان برای حفظ خاصیت ژنتیکی قارچ خوراکی است که طی آن نمونه بافت زنده را با حفظ خصوصیات والد آن تکثیر می‌کنند، درصورتی‌که برای کشت هاگ نژادهایی با خصوصیات جدید ایجاد می‌شوند.

نمونه بافت را باید از کلاهک‌هایی گرفت که ۲۴ الی ۴۸ ساعت از چیدن آن‌ها گذشته باشد و چنانچه از این حد فراتر رود، کلاهک خشک شده و یا خیلی پیر می‌شود که در آن صورت به‌ دست آوردن کشت خالص با مشکل روبه‌رو می‌شود.

با توجه به این‌که کل کلاهک ترکیبی از میسیلیوم های به هم فشرده است لذا می‌توان از هر قسمت آن‌که بخواهید یک کشت سالم ایجاد کنید.

اما بهتر است که نمونه را بیشتر به لبه کلاهک یا زیر آن بگیرید، سپس پوسته کوتیکولی ضخیم روی آن را برداشته و از بافت گوشتی زیر آن نمونه دل خواه را گرفته و بعد سطح آن را باریک پارچه‌ی نمدی آغشته به الکل، از هرگونه آلودگی احتمالی پاک نمایید، آنگاه سریعاً بعد از قرار دادن یک تیغ جراحی داغ داخل پتری دیش محتوی آگار آن را داخل بافت هیفی قارچ فروبرده و قطعه‌ی کوچکی از آن را جدا کنید بعد قطعه جداشده را به‌سرعت داخل پتری دیش پر از ماده غذایی منتقل کرده و حتی‌الامکان بافت و محیط آگار را از تماس با هوا دورنگه دارید.

آلودگی کشت بافت

این عمل را حداقل برای ۳ الی ۵ ظرف دیگر انجام دهید. سپس روی هر ظرف برچسبی حاوی گونه، تاریخ و نوع بافت کشت شده و نوع فرمول آگار مصرفی را بزنید.

با موفقیت در این مرحله طی 3 الی 7 روز میسلیوم ها جوانه می‌زنند. آستانه تحمل آلودگی در اکثر سالن‌های تولید ۱۰ درصد است ولی معمولاً در کشت‌های اولیه که به‌صورت مستقیم از بافت قارچ وحشی گرفته می‌شود این مقدار تا ۲۵% نیز می‌رسد.

کشت بافت بیشترین آلودگی را باکتری‌ها ایجاد می‌کنند.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا