چاپ اسپور قارچ برای اهداف شناسایی و انتخاب نژاد

چاپ اسپور یا کشت اسپور قارچ برای 2 هدف اصلی انجام می‌شود:

• پرورش قارچ
• شناسایی قارچ

مهمترین دلیل برای چاپ اسپور قارچ، بررسی رنگ هاگ‌ها برای اهداف شناسایی و انتخاب نژاد مناسب قارچ جهت تولید بذر (کشت اسپور قارچ) برای پرورش قارچ می‌باشد. همچنین یک راه بسیار ارزان برای پرورش قارچ و تولید بذر قارچ می‌باشد.

یکی از راه‌های تشخیص قارچ‌هایی که ظاهر یکسان دارند(تشخیص قارچ سمی از خوراکی) چاپ اسپور است زیرا رنگ هاگ هر گونه قارچ متفاوت است و الگوی متفاوتی ایجاد می‌کند.

برای پرورش قارچ یکی از اصلی‌ترین روش‌های انتخاب درون نژادی، استفاده از کشت اسپور قارچ است. این امر بر اساس واکنشی است که بازیدیوسپورها (Basidiospores) با یکدیگر نشان می‌دهند.

در اینجا باید توجه داشت که تک اسپورها با منشاء هتروکاریوتیک با تک اسپورهای با منشأ هموکاریوتیک به دلیل وضعیت پلوئیدی خود ممکن است تفاوت رشدی نشان دهند، اما سؤال این است که منشأ تنوع درون تک اسپورهای هتروکاریوتیک چه می‌تواند باشد؟

همانطور که گفتیم، به دلیل اینکه دو هسته غیر خواهری به درون یک بازیدیوسپور مهاجرت می‌کنند، قاعدتا تمامی اسپورهای تولیدی در اکثر مکانهای ژنی، شبیه والد خود و هتروزایگوس خواهند شد و ظاهرا نبایستی تنوعی مشاهده شود. اما در اینجا پدیده‌هایی که در ارتباط با تقسیم میوز رخ می‌دهند ممکن است باعث ایجاد تنوع نژادی شوند.

راه‌های شناخت همو کاریون‌ها

اولا ممکن است در هنگام تقسیم میوز و به وجود آمدن هسته‌ها، در برخی مکان‌های ژنی دور از سانترومر، به طور تصادفی کراسینگ اوور (crossing over) رخ دهد و در نتیجه هنگامی که دو هسته غیر خواهری به درون یک بازیدیوسپور مهاجرت می‌کنند، در برخی از مکان‌های ژنی خود دچار باز ترکیبی و یا حتی هموزایگوسیتی شوند.
همچنین ممکن است هنگامی که دو هسته مشابه خواهری به درون یک بازیدیوسپور مهاجرت می‌کنند. (همو کاریون غیرحقیقی)، در اثر کراسینگ آور مقداری هتروزایگوسیتی در برخی مکان‌های ژنی به وجود آید.

همین امر یکی از راه‌های شناخت این نوع همو کاریونها از هموکاریون‌های حقیقی است که از بازیدیوسپورهای با یک هسته میوزی به وجود آمدند و امکان بازترکیبی و هتروزایگوسیتی در مکان‌های ژنی را ندارند، می‌باشد.
نتیجه نهایی آنکه درصدی از نتاج هتروکاریوتیک معادل نصف احتمال وقوع کیاسما، باز ترکیب خواهند شد.

دوما آنکه برخی آنها ممکن است با پروموتورهای جدید یا نواحی تنظیمی سیس- اکتینگ (Cis- acting) در ارتباط باشند و بالاخره آنکه پدیده باز آرایی (Re – assortment) کروموزوم ها در هسته‌های هاپلوئید جدید، ممکن است محیط تنظیمی جدیدی برای برخی ژنها ایجاد نماید.
این مکانیسم‌ها به ویژه می‌تواند صفات با کنترل ژنتیکی از جمله سرعت رشد میسلیوم که یک صفت کمی محسوب می‌شود، را تحت تأثیر قرار دهد.

تنوع پرگنه (کلونی)

بخش مهم دیگری از این تفاوت مربوط به تنوعی است که تحت عنوان انواع شکل پرگنه شناخته می‌شوند. در همین جا است که بحث ناهنجاری های رشدی ژنتیکی (پایدار) و غیر ژنتیکی (ناپایدار) مطرح میشود.

انواع شکل پرگنه بیشتر به رشد طبیعی یا منحرف شده (ناهنجار) هيفها مرتبط می شود. ناهنجاریهای رشدی ژنتیکی یعنی آنکه تفاوت هيف ناهنجار با هیف طبیعی ذاتی است و به ارث می رسد.

ناهنجاریهای غیر ژنتیکی در اثر محیط کشت و دفعات زیر کشت و نگهداری طولانی مدت ایجاد می شود و ممکن است به پسروی نژادی منجر شود.

البته این تنوعات بعدا ممکن است حتی به ارث هم برسند. در هر حال، اساس ژنتیکی و نحوه عمل انواع شکل پرگنه هنوز کاملا مشخص نیست.

با توجه به مجموع این مکانیسم‌ها، می‌توان انتظار داشت که کشت‌های تک اسپوری یا قسمتهای مختلف یک کشت چنداسپوری تا حدودی با یکدیگر تفاوت نشان دهند.

هنگامیکه هدف از یک برنامه اصلاحی، انتخاب درون نژادی به ویژه بازیابی عملکرد یک نژاد باشد، استفاده از این تفاوت‌ها سودمند است. اما این روش فقط باعث کشف و حفظ بازترکیبی‌ها (یا پتانسیل بازترکیب‌پذیری در درون یک نژاد) میشود.

برای استفاده از پتانسیل ژنتیکی چند نژاد باید روش‌های دیگری مورداستفاده قرار گیرند که در ادامه به آنها اشاره می‌شود.

تهیه نقش اسپور قارچ

روش اصلی چاپ اسپور قارچ بسیار ساده است. کلاهک یک قارچ بالغ و تولید کننده هاگ را روی یک سطح صاف مانند کاغذ یا فویل آلومینویومی قرار دهید و به اندازه کافی صبر کنید تا هاگ‌های آزاد به چیزی قابل مشاهده تبدیل شوند. هاگ‌ها به قدری ریز هستند که به سطح می‌چسبند و مانند گرد و غبار گچ یا زغال به آن رنگ می‌دهند. از این رو کلمه “چاپ اسپور” یا “spore print” به آن می‌گویند.

برای انجام کشت‌های تک و چند اسپوری، ابتدا باید نقش اسپور (Spore print) تهیه شود. برای تهیه نقش اسپور ابتدا یک عدد قارچ متوسط تازه قبل از اینکه پرده زیر کلاهک باز شده باشد، انتخاب می‌شود.

قسمت پایه قارچ قطع و کلاهک قارچ تمیز می‌شود. سپس پرده زیر کلاهک با چاقوی جراحی حذف و کلاهک به یک ظرف پتری بر روی یک کاغذ صافی ضدعفونی منتقل می‌شود. معمولا بعد از ۷۲-۴۸ ساعت، نقش اسپور در کاغذ صافی تشکیل می‌شود.

کاغذ صافی حاوی نقش اسپور را می‌توان به نوارهای باریکی تقسیم و این نوارها را در لوله های ۱۸ میلی لیتری در محیطی خشک و سرد (حداکثر ۴°C) حتی تا یک سال نگهداری کرد.

مراحل چاپ اسپور :

• یک قارچ بالغ پیدا کنید (قارچ های نابالغ هاگ تولید نمی‌کنند).
• بدون دست زدن به آبشش ها، کلاهک را از ساقه جدا کنید و لبه های آن را تا رسیدن به آبشش ها با وسیله ای تیز ببرید.
• کلاهک را از طرف اسپور به سمت پایین روی یک سطح صاف مانند کاغذ، شیشه، فویل آلومینیوم یا چوب قرار دهید.
• کمی آب بر روی کلاهک قارچ بچکانید تا اسپور آزاد شود و با یک کاسه یا فنجان آن را بپوشانید.
• 24 ساعت صبر کنید (برخی از قارچ‌ها در کمتر از 2 ساعت یک چاپ اسپور قابل مشاهده تولید می‌کنند، اما 24 ساعت صبر کردن، اطمینان حاصل می‌کند که چاپ خوبی داشته باشید).
• کلاهک قارچ را با یک انبر به آهستگی از روی سطح بردارید. (هرگونه حرکت جانبی که می تواند چاپ را لکه دار کند)
• نقش چاپ شده را درون کیسه استریل زیپدار در مکانی تاریک و خنک نگهداری کنید.

اگر برای تکثیر قارچ، چاپ اسپور را انجام می‌دهید، از ورق شیشه‌ای شفاف برای چاپ استفاده کنید، زیرا شیشه به راحتی استریل می‌شود. همه ابزارها و مواد (به جز قارچ) باید قبل از استفاده استریل شوند تا از ورود هرگونه آلودگی جلوگیری شود.

 

ویدیوی آموزشی چاپ اسپور (spore print)

در این ویدئو با آموزش گرفتن هاگ قارچ به روش چاپ یا پرینت قارچ و تهیه سرنگ اسپور همراه ما باشید. تهیه سرنگ اسپور شاید کمی مشکل باشد اما بهترین و راحت‌ترین روش برای تلقیح هاگ می‌باشد.

این ویدیو شامل سه بخش است:
در بخش اول می‌توانید نحوه پرینت اسپور گرفتن از قارچ‌های فضای باز، بخش دوم نحوه تهیه پرینت از قارچ‌های پرورشی خودتان و در آخرین بخش نحوه آماده کردن سرنگ با اسپور پرینت را مشاهده کنید.

 

مکانیسم تندش بازیدیوسپورها

به منظور تندش بازیدیوسپورها، باید یک مایع تعلیقی از اسپورها تهیه کرد. این مایع تعلیقی ابتدا به صورت خیلی غلیظ تهيه و سپس برای رقت مناسب آماده می‌شود.

برای تنظیم رقت مناسب اسپورها، از یک لام گلبول شمار استفاده میشود. در طی تحقیقات نسبتا زیادی که در دو دهه اخیر انجام شد، رقت‌های مختلفی برای تضمین موفقیت کشت اسپور قارچ، گزارش شد.

اما آنچه که رایج است و بیشتر مورد اطمینان می‌باشد آن است که با استفاده از لام گلبول شمار، رقت ۱۰۰ اسپوربر میلی لیتر تهیه و برای کشت در هر ظرف پتری، ۲۸۱۰۴ اسپور از آن برداشته می‌شود.

در تمام این مراحل باید حداکثر سعی را به کار برد تا از هرگونه آلودگی اجتناب شود، چرا که کشت اسپور قارچ به آلودگی به ویژه آلودگی باکتریایی بسیار حساس است(Horgen et. al., 1989).

بازیدیوسپورها

اصولا، بازیدیوسپورها به دو گروه تقسیم می‌شوند:

(الف) گروه اول که تعداد آنها بسیار کم است (در حدود ۵٪ کل بازیدیوسپورها)، در حقیقت،  تندش کننده های اولیه هستند و بدون تحریک خارجی و فقط با وجود رطوبت و محیط غذایی کافی تندش می کنند.

این گروه از بازیدیوسپورها از نوع اسپورهای با خواب برونزادی (Exogenously dormant spores) هستند. برای آنکه تعداد تندش کننده‌های اولیه در یک کشت اسپور به اندازه کافی زیاد باشد، باید تراکم بازیدیوسپورها برای جدا کردن تک اسپورها مناسب باشد و همچنین مقدار حجم مایع تعلیقی با سطح ظرف پتری متناسب باشد.

لذا باید رفت مایع تعلیقی اسپورها  در حدود ۲۶۱۰ اسپور برای هر ظرف پتری معمولی با قطر ۱۰cm باشد.

(ب) گروه دوم بازیدیوسپورها آنهایی هستند که اصطلاحا تندش کننده های تأخیری نامیده می شوند. این دسته  از بازیدیوسپورها برای تندش علاوه بر رطوبت و محیط کشت کافی، نیاز به یک عامل تحریک کننده دارند. در واقع، این بازیدیوسپورها دارای خواب ساختمانی (Constitutively dormant spores) هستند.

روش تحریک بازیدیوسپورها

برای تحریک تندش این دسته از بازیدیوسپورها، می توان یک پرگنه یک هفته ای (به قطر ۱  – ۲cm) از کشت بافت قارچ دکمه‌ای سفید را در محیط کشت اسپور قرار داد. این کشت یک هفته‌ای از میسلیوم می‌تواند به دلایلی، بازیدیوسپورهای تأخیری را تحریک به تندش کند.

یکی از نظریاتی که در این ارتباط بیان شده آن است که در قطعه میسلیوم تحریک کننده یک ماده فرار به نام ایزووالرات (Isovalerate) وجود دارد که می تواند CO را که ممانعت کننده تندش است، حذف نماید. غلظت پایین CO یکی از ملزومات تندش است.

کشت تحریکی به این شیوه در کشت اسپور قارچ Volvariella bombycina نیز کاربرد دارد (1989 ,.Horgen et  . al ). همانطور که ذکر شد، یکی از مشکلات عمده محققین برای اصلاح این قارچ، وجود آلودگی باکتریایی در کشتهای اسپور می‌باشد.

آلودگی باکتریایی می‌تواند از طریق رعایت بهداشت در جمع‌آوری اسپورها، نگهداری در شرایط بهداشتی، تنظیم صحیح دقت کشت اسپور و استفاده از استروپتومایسین به میزان ۲۵ میکروگرم بر میلی‌لیتر برطرف شود.

نگهداری کشت های اسپور در درجه حرارت مناسب بسیار حائز اهمیت است. درجه حرارت بالاتر از ۲۵°C باعث می‌شود که خطر از بین رفتن اسپورها افزایش یابد. در مقابل درجه حرارت کمتر از ۲۰°C باعث میشود که دمای لازم برای تندش اسپورها فراهم نشود.

در طی تحقیقات مختلف ثابت شدکه بهترین دما برای تندش مطلوب بازیدیوسپورها ۲۵°C است (شکل ۳-۶). مکانیسم تندش بازیدیوسپورها نکات بسیار زیادتری دارد که از حوصله این کتاب خارج است. پس از کشت اسپور، گزینش تک یا چنداسپوری انجام می‌شود.

گزینش تک اسپوری

با توجه به روشی که در کشت اسپور قارچ گفتیم، از 5 تا 12 روز بعد از کشت اسپور، می‌توان منتظر تندش بازیدیوسپورها بود.

ابتدا هر کدام از بازیدیوسپورهای تندش (که لوله تندش آنها با میکروسکوپ و  پرگنه آنها با چشم غیرمسلح قابل رؤیت باشد) به یک ظرف پتری حاوی محیط کشت مناسب منتقل می‌شود.

تقریبا بعد از گذشت ۲۵-۲۰ روز، میسلیوم این تک اسپور بیشتر سطح ظرف پتری را اشغال می‌کند.

اگر از کشتهای تک اسپور به اندازه کافی در اختیار باشد، می‌توان تنوع مورفولوژیکی محسوسی را در بین آنها مشاهده کرد. مرحله ۱ گزینش تک اسپوری نیز براساس همین تنوع است.

منشأ این تنوع را در بخش ۳-۲ توضیح دادیم. این تفاوت‌های مورفولوژیکی باعث ایجاد تیپ‌های رشدی مختلف می‌شود. هر تیپ رشدی خود از دو جزء مهم، شکل پرگنه و سرعت رشد میسلیوم تشکیل یافت.

از نظر شکل پرگنه، می‌توان انواع رشته‌ای (Strandy)، کرکی (Fluffy)، پنبه ای (Cottony) و بدون میسلیوم هوایی (Appressed) را مشاهده کرد.

خصوصیات تک اسپور

از نظر سرعت رشد نیز می‌توان انواع سریع، متوسط، کند و بسیار کند را در کشت های تک اسپور تشخیص داد. در جایی که هدف از انتخاب درون نژادی، بهبود عملکرد یک نژاد باشد، باید کشت های تک اسپوری را که تیپ رشدی آنها از نوع رشته ای و سریع است، انتخاب و از آنها بذر تهیه کرد.

می توان مشابه همین گزینش را نیز در مرحله اسپاون برای انواع اسپاونهای مربوط به کشت های تک اسپور انجام داد. اسپاون‌های انتخابی در آزمایشات میوه دهی در حجم کم و در نهایت در آزمایشات میوه دهی تکراردار در حجم زیاد جهت ارزیابی دقیق مورداستفاده قرار می‌گیرند (گردان و فارسی، ۱۳۸۳).

اما در جایی که هدف، انتخاب انواع ویژه‌ای از تک اسپورها باشد، به نحوی که بتوان از آنها 2 برنامه‌های هیبریداسیون برون نژادی استفاده کرد، نحوه دیگری از گزینش باید انجام شود که در بخش بعدی تشریح خواهند شد.

شکل ۴-۶ تنوعی را نشان می‌دهد که ممکن است در کشت‌های تک اسپوری به نژاد دیده شوند.

گزینش چند اسپوری

گزینش چنداسپوری یکی از قدیمی‌ترین و ساده‌ترین روش‌های گزینش برای قارچ دکمه‌ای است. برای گزینش چنداسپوری می‌توان به همان روشی که قبلا گفتیم، کشت اسپور قارچ انجام و سپس اجازه داد تا سطح ظرف پتری توسط میسلیوم‌های ناشی از تندش اسپورها اشغال شود.

14 الی 20 روز بعد، هر کشت چنداسپوری انواع مختلفی از تیپ‌های رشد را نشان می‌دهد.

لذا از نواحی مختلف هر کشت، می‌توان زیر کشت گرفت. سپس از انتهای پرگنه هر زیر کشت، دوباره زیر کشت انجام داد و درنهایت کشت های حاصله را با هم مقایسه کرد. حتی می‌توان بین کشت‌های چنداسپوری یک نژاد که هر کدام از نقش اسپورهای متفاوت گرفته شده است، گزینش انجام داد.

برخی از محققین معتقدند که برای به نژادی نژادهای موجود در یک کشور، بهترین روش استفاده از گزینش چنداسپوری است (1994 ,Mehta and Bhandal).

 

کشت اسپور قارچ (تولید میسلیوم قارچ)

با تهیه‌ هاگ‌های سالم به روش‌های ساده می‌توان به یک نژاد نسبتاً سالم دست یافت. در صورت جوانه‌زنی توده هاگ، نژادهای متنوعی ایجاد می‌شوند که گاهی ممکن است با یکدیگر سازگاری نداشته و هر یک از آنها در شرایط مصنوعی آزمایشگاهی به لحاظ روش و مقدار محصول تفاوت زیادی باهم داشته باشند.

کشت هاگ که در حقیقت ‌نوعی تکثیر جنسی است دارای کیفیت و کمیت متنوعی می‌باشد که از آن می‌توان برای تولید اسپان قارچ استفاده کرد.

روش دوم  تولید بذر، کشت بافت نام دارد که در حقیقت نوعی تکثیر غیرجنسی است، که به علت شباهت بالای محصول تولیدی با والدین خود، بیشتر در تکثیر قارچ‌هایی که از نظر کیفیت و محصول در حد مطلوبی هستند استفاده می‌شود.

پرورش‌دهندگان قارچ، کشت هاگ را به دلیل آسانی استفاده، تشکیل و  ماندگاری بالا در دستور کار خود قرار می‌دهند.

تهیه هاگ سالم از چاپ اسپور قارچ

مرحله اول کشت هاگ جمع‌آوری هاگ سالم از قارچ های سالم است. برای این کار کلاهک سالم، تازه و تمیزی را از ساقه جدا می‌کنیم و بطور واژگون روی یک کاغذ سفید و سطح شیشه‌ای حدود 2 ساعت قرار می‌دهیم.

اگر کلاهک خشک باشد، جهت رهاسازی آسان‌تر هاگ یک یا دو قطره آب مقطر به‌منظور جلوگیری از کاهش تبخیر به  کلاهک قارچ اضافه می‌کنیم و یک بشر روی آن قرار می‌دهیم.

بعد از چند ساعت که هاگ‌ها کاملاً  از کلاهک رها شدند و نقش تیغه کلاهک روی کاغذ خواهد افتاد، کاغذ هاگ‌ها را بریده و از وسط تا می‌زنیم و دریک ظرف در بسته قرار داده و روی آن برچسبی حاوی زمان جمع‌آوری، گونه قارچ و شماره جمع‌آوری می‌زنیم.

هنگامی که از لامل برای جمع‌آوری هاگ استعمال شود، هاگ‌ها را مابین دو لامل قرار می‌دهیم و دورتادور لبه‌ی این دو لامل را با نوارچسب می‌چسبانیم تا از نفوذ هاگ‌های آلاینده جلوگیری کنیم.

در صورت عدم رعایت این نکات محیط کشت مبتلا می‌شود و امکان عمل‌آوری یک هاگ خالص کاهش می‌یابد.

بخش زیرین قارچ‌های دکمه‌ای یک غشاء نازک به نام پرده دارد، که از لبه‌ی کلاهک تا پایه قارچ ادامه دارد و از هاگ‌ها در برابر شرایط نامساعد محیطی و آلاینده‌ها حفاظت می‌کند.

هنگام انتخاب نمونه، قارچ‌هایی باید انتخاب شود که پرده آن‌ها هنوز پاره نشده باشد تا با برداشتن دقیق و استریل این پرده به هاگ‌های خاص‌تری دست پیدا کرد.

تکنیک‌ های جوانه‌ زنی هاگ

پس از تهیه هاگ لازم و مطلوب می‌توان شروع به کشت کرد. در ابتدا حلقه‌ تلقیح یا تیغ جراحی را با حرارت شعله به مدت ۱۰ ثانیه استریل کنید. سپس آن را داخل یک پتری دیش حاوی محیط کشت استریل فرو کنید و اجازه دهید تا خنک شود.

سپس به‌ وسیله‌ آنها هاگ‌ها را کم‌کم از روی کاغذ بردارید و بصورت خط‌خطی یا زیگزاگ بر روی سطح آگار پخش می‌کنیم. برای اینکه جوانه‌‌زنی هاگ‌ها بهتر باشد می‌توان بطور همزمان 3 پتری دیش را باهم تلقیح کنیم که به این روش کشت چندگانه یا توده‌ای هاگ می‌گویند.

جذب رطوبت

با گذشت زمان از لحظه تلقیح، هاگ‌ها رطوبت را محیط کشت جذب می‌کنند و متورم می‌شوند .اگر در این مرحله رطوبت به‌ اندازه کافی به هاگ‌ها نرسد، هاگ ها چروکیده شده و به‌راحتی جوانه نخواهند زد.

برای برطرف نمودن کاستی رطوبت می‌توان با مرطوب کردن هاگ‌ها و پتری با آب استریل، جوانه‌زنی آن‌ها را بهبود بخشید. برای مرطوب کردن آنها می‌توان از قطره‌چکان نیز  استفاده کرد.

با قرار دادن پتری‌ها بصورت وارونه در محیط و دمای 20-25 درجه و انتظار شرایط برای جوانه‌زنی هاگ‌ها مهیا خواهد شد.

۳ الی ۷ روز بعد از تلقیح هاگ جوانه می‌زند و بصورت رشته‌های سلولی نخ مانند به نام هیف منشعب از یک نقطه‌ی مرکزی در سطح محیط کشت ظاهر می‌شوند. با گسترش این رشته‌ها و در هم رفتن آن‌ها، شبکه میسلیومی به وجود می‌آید که در ابتدا به‌ صورت غیر مستقیم و به رنگ خاکستری بوده و بعد از مدت کمی با تقسیم و تکثیر هیف‌های بیشتر آنها در محیط کشت به رنگ سفید درمی‌آیند.

میسلیوم های قارچ

رنگ میسلیوم  قارچ دکمه‌ای ، شیتاکه، قارچ رقیب کلاهدار، پانالوس و سیلوسایبین، خاکستری مایل به سفید است و در گونه‌های همچون Iepista nuda آبی مایل به ارغوانی و گونه‌ای خاص از سیلوسایبین قهوه‌ای است. درمجموع تنوع رنگ تابع نژاد قارچ، روش تکثیر و محیط رشد است.

از خصوصیات ظاهری میسلیوم‌ها می‌توان به نوع رویش آن اشاره کرد که از این نظر که به انواع هوایی، مسطح، پنبه، یا ریشه‌ای شکل می‌شود.

میسلیوم هوایی در گونه‌هایی که در نواحی مرطوب رشد می‌کنند،دیده می‌شود. میسلیوم مسطح، بیشتر در شرایط خشک دیده می‌شود.

مراقبت از محیط کشت قارچ

با توجه به اینکه بسیاری از آلودگی‌های متداول، ناشی از کپک‌های هاگ‌زا هستند. باید مراقب بود تا محیط کشت اسپور قارچ را تکان نداده و یا کاری نکرد که باعث انتشار هاگ‌های این قبیل قارچ‌ها شود و همچنین باید از خنک بودن تیغ جراحی قبل از ورود آن به داخل محیط آگار اطمینان حاصل کرد، زیرا یک تیغ و یا هرگونه وسیله داغ که به داخل آگار وارد می‌شود، باعث تولید بخار ناگهانی درون پتری دیش می‌شود و درنتیجه موجب رهاسازی هاگ کپک‌های مجاور می‌گردد.

در صورت ایجاد یک ترکیب غیر یک دست ژنتیکی، کل عملکرد محصول دچار اسیب های جبران ناپذیری خواهد شد.  در این توده غیر یکنواخت ژنتیکی نژادهای کم بازده مانع فعالیت نژادهای پربازده خواهند شد.

از بین تعداد کثیری از نژادهای ایجادشده در کشت توده‌ای هاگ، ممکن است تنها اندکی از آن‌ها قادر به جذب مواد غذایی و آب خواهند بود اما توانایی تولید اندام باردهی یا کلاهک را ندارند.

مونوکاریون و هتروکاریون

به شبکه سلولی حاصل از یک هاگ که عموماً هاپلوئید و دارای یک هسته هستند مونوکاریون گفته می شود. این میسیلیوم ها فاقد توانایی باروری هستند.از برخورد دو مونوکاریون سازگار باهم، مواد سلولی و ژنتیکی آن‌ها باهم مبادله شده و یک میسلیوم دو هسته ایجاد می‌شود که قادر به باروری است.

چنین اتفاقی در هر مرحله‌ای از تولید اتفاق می‌افتد. تلاقی نژادهای خویشاوندی قارچ‌ها باهم، مشابه ایجاد گیاهان دو رگه در باغبانی است.

ایجاد ایزوله‌ ها

روش دیگر کشت هاگ، ایجاد ایزوله‌ های یک هاگ و رقیق‌ سازی هاگ‌ ها با کمی آب مقطر است. محلول هاگ حاصل را می‌توان با انتقال آن به ظرف حاوی آب مقطر بیشتری، رقیق کرد که به ‌نوبه خود از آن می‌توان برای تلقیح نهایی در ظروف کشت استفاده کرد.

پرورش‌ دهنده با این روش می‌تواند هر یک از میسلیوم های جوان تک‌ هسته‌ای را ببیند. یک زمان‌ بندی برای تلاقی جهت توسعه نژادهای پربازده ایجاد کنید.

با توجه به شرایط محیطی و تازگی و سلامت هاگ هااز هر ۱۰۰ گرم هاگ، عموماً ۱ تا ۵ عدد هاگ جوانه می‌زنند.

خطرات تهدید کننده اسپورها

از بزرگترین خطراتی که متوجه کشت‌ های توده اسپوری است، افزایش مقدار آلودگی به‌ویژه آلودگی باکتریایی است. امکان بیماری و آلودگی برخی از نژادهای خویشاوند وجود دارد که در صورت جوانه‌‌زنی توده‌‌ای آنها، احتمال پخش آلودگی در محیط زیاد می‌شود.

بسیاری از قارچ‌ها دارای یک رابطه همزیستی مناسبی با دیگر موجودات هستند. مثلاً باکتری‌ها و مخمرها قادر هستند جوانه‌زنی هاگ‌ هایی که در شرایط استریل و به‌تنهایی بسیار مشکل انجام می‌شوند را تسهیل نمایند.

با اضافه شدن عمدی یا اتفاقی برخی باکتری‌های خاص به تعدادی از محیط‌های کشت، می‌توان رشد و نمو آن‌ها را تشدید کرد.

کشت بافت

کشت بافت، روشی قابل‌ اطمینان برای حفظ خاصیت ژنتیکی قارچ خوراکی است که طی آن نمونه بافت زنده را با حفظ خصوصیات والد آن تکثیر می‌کنند. درصورتی‌که برای کشت هاگ نژادهایی با خصوصیات جدید ایجاد می‌شوند.

نمونه بافت را باید از کلاهک‌هایی گرفت که ۲۴ الی ۴۸ ساعت از چیدن آن‌ها گذشته باشد. چنانچه از این حد فراتر رود، کلاهک خشک شده و یا خیلی پیر می‌شود که در آن صورت به‌ دست آوردن کشت خالص با مشکل روبه‌رو می‌شود.

با توجه به این‌که کل کلاهک ترکیبی از میسیلیوم‌های به هم فشرده است، لذا می‌توان از هر قسمت آن‌که بخواهید یک کشت سالم ایجاد کنید.

اما بهتر است که نمونه را بیشتر به لبه کلاهک یا زیر آن بگیرید. سپس پوسته کوتیکولی ضخیم روی آن را بردرید و از بافت گوشتی زیر آن نمونه دلخواه را بگیرید. بعد سطح آن را باریک پارچه‌ نمدی آغشته به الکل، از هرگونه آلودگی احتمالی پاک نمایید. آنگاه سریعاً بعد از قرار دادن یک تیغ جراحی داغ داخل پتری دیش محتوی آگار آن را داخل بافت هیفی قارچ فروببرید. قطعه‌ی کوچکی از آن را جدا کنید بعد قطعه را به‌سرعت داخل پتری دیش پر از ماده غذایی منتقل کنید. حتی‌الامکان بافت و محیط آگار را از تماس با هوا دورنگه دارید.

آلودگی کشت بافت

این عمل را حداقل برای ۳ الی ۵ ظرف دیگر انجام دهید. سپس روی هر ظرف برچسبی حاوی نوع، تاریخ و نوع بافت کشت‌شده و نوع فرمول آگار مصرفی را بزنید.

با موفقیت در این مرحله طی 3 الی 7 روز میسلیوم ها جوانه می‌زنند. آستانه تحمل آلودگی در اکثر سالن‌های تولید ۱۰ درصد است. ولی معمولاً در کشت‌های اولیه که به‌ صورت مستقیم از بافت قارچ وحشی دریافت می‌شود این مقدار تا ۲۵% نیز می‌رسد.

کشت بافت بیشترین آلودگی را باکتری‌ها ایجاد می‌کنند.

 

مولف:

گردآوری، ترجمه و تحریر توسط تیم رسانه هاگ
کپی فقط با ذکر منبع مجاز است.