آکادمی قارچآموزش

تولید بذر

در این بخش قصد شده است تا با توضیحاتی مفید و اجمالی، اطلاعات اولیه و پایه ای تولید بذر را در اختیار شما عزیزان قرار دهیم.

مراحل تهیه اسپان

مراحل ضروری تهیه اسپاون به قرار زیر است. این مراحل طوری است که در هر مرحله، مقدار میسلیوم افزایش پیدا می کند.

  • کشت مادری در آگار
  • کشت های تلقیحی در ظروف پتری
  • کشت اسپاون مادری درون شیشه ها با کیسه های پلاستیکی
  • کشت اسپاون تجاری درون کیسه های پلاستیکی

به منظور جلوگیری از ورود آلودگی به اسپاون در طی انتقال میسلیوم، مراحل چهارگانه فوق بایستی در شرایط استریل در زیر هود لامینارایرفلو انجام شود. محیطی که اسپاون به آن منتقل می شود نیز بایستی کاملا استریل باشد. میزان رشد و قدرت اسپاون تحت تأثیر نوع نژاد، محیط کشت، زمان نگهداری و درجه حرارت است.

 کشت مادری در آگار و کشت های تلقیحی در ظروف پتری

برای تلقیح (Inoculation) ماده زمینه ای با میسلیوم قارچ تکمه ای و تهیه یک اسپاون کامل و مرغوب، ابتدا بایستی از میسلیوم قارچ تکمه ای یک کشت خالص (Pure culture) تهیه شود (شکل ۴-۳). کشت خالص در واقع، هیفهای بدون آلودگی از یک نژاد (Strain) یا یک جدایه (Isolate) معین از قارچ تکمه ای سفید است. این کشت بایستی به قدر کافی هیف داشته باشد تا بتواند ماده زمینه ای را تلقيح و از آن برای ادامه رشد استفاده کند. تولید کشت خالص به طور تفصیلی در فصل۶، بخش روشهای مختلف اصلاحی، تشریح خواهد شد. در این قسمت به طور خلاصه روش تهیه محیط کشت غذایی برای رشد میسلیوم بیان می شود.

یکی از مرسوم ترین محیط های غذایی برای کشت اسپور و یا تکثیر میسلیوم استفاده از محیط غذایی PDA است. نحوه تهیه این محیط غذایی به شرح زیر میباشد:. مواد مورد نیاز: ۲۰۰ گرم سیب زمینی ورقه شده، ۲۰ گرم پودر آگار، ۲۰ گرم دکستروز یا شکر سفید معمولی و آب تا حجم یک لیتر. روش کار: سیب زمینی ها را بشویید و ورقه ورقه کنید. آنها را به مدت ۱۵ تا ۲۰ دقیقه بجوشانید تا نرم شوند. سیب زمینی ها را بردارید و حجم آب را دقیقا به یک لیتر برسانید. قند و آگار را اضافه کنید. مقدار قند و آگار بایستی دقیق باشد وگرنه محیط خیلی سفت و یا خیلی شل خواهد شد. محیط را در حین به هم زدن به آرامی گرم کنید تا آگار ذوب شود. تا زمانی که هنوز محیط غذایی داغ است (۵۰°C)، آن را در محیط استریل به ظروف پتری و یا لوله های آزمایش استریل منتقل کنید. در صورت استفاده از لوله های آزمایش، فقط یک چهارم لوله های آزمایش را با محیط غذایی پر کنید و لوله های آزمایش را به صورت مورب (۴۵ درجه) بگذارید تا محیط غدایی سفت شود. در صورت استفاده از ظرف پتری، ضخامت محیط غذایی را ۵ تا ۷ میلی متر بگیرید.

برای تکثیر میسلیوم روی محیط کشت می توان از فرمول زیر که ارزان تر است، نیز استفاده کرد.

مواد موردنیاز:

۲۰۰ گرم برنج، ۱ لیتر آب، ۲۰ گرم ژلاتین

روش کار:

برنج را به مدت ۱۰ دقیقه بجوشانید، آن را با پارچه صاف کنید. مایع ردشده از صافی را نگهدارید. ۲۰ گرم ژلاتین به آن اضافه کنید و سپس آن را استریل نمایید. پس از سرد شدن به ۵۰°C به ظروف پتری منتقل کنید.|

همچنین می توانید از گندم برای تهیه محیط کشت استفاده کنید.

مواد موردنیاز:

۳۲ گرم گندم، ۲۰ گرم آگار و یک لیتر آب.

روش کار:

گندم را در یک لیتر آب به مدت دو ساعت بجوشانید. پس از ۲۴ ساعت محلول را از صافی عبور دهید و حجم محلول صاف شده را به یک لیتر برسانید. آگار را به آن اضافه کنید و پس از هضم کردن ‘ کار در محلول، آن را اتو کلاو نمایید.

اگرچه برای تهیه محیط کشت میسلیوم در اکثر منابع استفاده از آب مقطر دیونیزه (بدون يون) توصیه شده است، اما واقعا ضرورتی ندارد. البته در آزمایشات علمی که بایستی مقدار و غلظت هر ماده ای در محیط کشت دقیقا کنترل شود، استفاده از آب مقطر دیونیزه الزامی است چون آب معمولی حاوی املاح و عناصر متعددی است. همین مطلب در مورد آگار نیز مصداق دارد. برای محیط غذایی رشد میسلیوم در ظرف پتری نیازی به آگار بسیار خالص و گران قیمت نیست.

pH محیط غذایی برای تکثیر میسلیوم و یا اسپاون بایستی در حد خنثی باشد. قابل ذکر است که آگار نمی تواند محیط غذایی اسیدی را در صورت اتوکلاو کردن سفت نماید.

در صورت رعایت نکات بهداشتی و رعایت درجه حرارت، فشار و زمان مناسب اتوکلاو، به احتمال قوی آلودگی نخواهید داشت. با این وجود، اگر محیط غذایی هنوز آلودگی داشت می توانید از آنتی بیوتیک های عمومی مثل جنتامایسین و تتراسایکلین استفاده کنید. جنتامایسین قابل اتو کلاو کردن است یعنی در اثر اتوکلاو کردن اثر خود را از دست نمی دهد. لذا می توانید آن را قبل از اتوکلاو کردن به محیط غذایی اضافه کنید. اما تتراسایکلین بایستی پس از اتو کلاو کردن و سرد کردن محیط غذایی، در زیر هود استریل به آن اضافه شود.

در صورت استفاده از لوله های آزمایش و ظروف پتری شیشه ای پیرکس، می توانید ابتدا محیط غذایی را به اندازه کافی در آنها بریزید و درب آنها را با ورقه های آلومینیومی بپوشانید و سپس آنها را به آرامی در اتوکلاو قرار دهید. با این وجود، می توانید محیط غذایی را در ارلن های نیم و یا یک لیتری بریزید و درب آنها را با ورقه آلومینیومی بپوشانید و پس از اتو کلاو کردن، و سردشدن محیط غذایی به حدود ۵۰°C، آن را به لوله های آزمایش و ظروف پتری استریل شده منتقل کنید.

در صورت استفاده از ظروف پتری پلاستیکی، طریقه اول ممکن نیست. ابتدا بایستی محیط غذایی در ارلن اتو کلاو شود و سپس به این ظروف پتری منتقل گردد. این ظروف پتری قبلا توسط شرکت سازنده با اشعه گاما استریل شده اند. وقتی درب کیسه پلاستیکی حاوی ظروف پتری پلاستیکی باز شد، بایستی همه آنها را در همان مرحله استفاده کنید. باقی گذاشتن چند ظرف پتری در هوای آزاد باعث نقوذ باکتری ها و اندام های تکثیری قارچها به درون آنها میشود. |

اگر پس از انتقال ریزنمونه، ظرف پتری آلوده شد، یعنی قارچها یا باکتریهای رقیب در آن رشد کردند فقط در صورتی که آلودگی مربوطه تماسی با ریزنمونه ندارد، سعی شود که ریزنمونه با دقت از ظرف پتری خارج شده و به محیط جدیدی منتقل شود. هرگز قسمت آلوده را مستقیما حذف نکنید، چرا که با دست زدن به قسمت آلوده، ممکن است اسپورهای قارچ رقیب پخش شوند.

پس از تهیه کشت خالص، نوبت به تهیه اسپاون مادری و سپس اسپاون تجاری می رسد. اصولا نژاد مورداستفاده عامل اصلی تعیین کننده ارزش یک اسپاون است، اما برخی نکات مهم در طی فرایند تهیه اسپاون وجود دارد که رعایت آنها می تواند نقش مثبت نژاد را تشدید و یا در صورت عدم رعایت از اهمیت آن بکاهد. باید توجه داشت که تهیه اسپاون هم یک هنر محسوب می شود و هم ایجاب می نماید تا از آخرین دستاوردهای تحقیقاتی در تهیه یک اسپاون مناسب استفاده شود. ادامه مراحل مختلف تهیه اسپاون به قرار زیر است:

 کشت اسپاون مادری درون شیشه ها و کشت اسپاون تجاری درون کیسه پلاستیکی:
انتخاب ماده زمینه ای مناسب

برای اینکه میسلیوم قارچ به بستر کشت منتقل شود، بایستی ابتدا آن را در یک ماده زمینهای تکثیر کرد، چون انتقال میسلیوم از ظرف پتری به کمپوست مقرون به صرفه نیست و نمی توان آن را به صورت همگن در

کمپوست توزیع کرد. هم اکنون در اکثر موارد، از بذر غلات برای ماده زمینه ای اسپاون، استفاده می شود. رایج ترین بذر مورداستفاده، بذور چاودار، ارزن و گندم است. به دلیل فراوانی گندم از این غله استفاده می شود. گندم مورداستفاده برای اسپاون بایستی تازه باشد، یعنی همان سال برداشت شده باشد، دانه های شکسته و ضایعات اضافی نداشته باشد. همچنین بایستی فاقد آلودگی باکتریایی باشد.

آماده سازی ماده زمینه ای
الف) جوشاندن و خیساندن

سرعت توسعه شبکه میسلیومی در ماده زمینهای موردنظر، ارتباط مستقیمی با محتوای رطوبت آن دارد. این محتوای رطوبتی می تواند سرعت رشد میسلیوم ها را کم یا زیاد کند. آنچه که باعث می شود محتوای رطوبتی ماده زمینه ای بالا رود، جوشاندن و خیساندن دانه های موردنظر است. جوشاندن، همچنین باعث می شود که دانه موردنظر نرم و قابل نفوذ شده و شبکه میسلیوم قارچ بتواند در آن نفوذ کرده و از آن برای تغذیه و رشد خود استفاده کند. علاوه بر این، جوشاندن باعث می شود که برخی از آلودگی های عمده موجود در دانه ها تاحدودی از بین بروند.

روش های متعددی برای جوشاندن و خیساندن ارائه شده است. اینکه کدام یک از این روش ها باید هستند، به تجربه ای بر می گردد که محقق مربوطه به دست آورده است. لذا نمی توان با اطمینان گفت کدام روش بهتر از سایر روش ها است. با این وجود، برخی اصول در جوشاندن و خیساندن وجود دارد که در تمام این روش ها یکسان است. به عنوان مثال، در یک روش مبتنی بر یافته های مرکز تحقیقات قارچ های خوراکی جهاددانشگاهی مشهد می توان ۱۰ کیلوگرم دانه چاودار یا گندم را در ۱۲ لیتر آب به مدت ۲۰ دقیقه جوشاند و سپس دانه ها را در آب جوشیده به مدت ۱۰ دقیقه نگه داشت.

ب) خشک کردن

تنظیم pH و جلوگیری از لزج شدن ماده زمینهای موقعی که عمل جوشاندن و خیساندن تمام شد، باید اجازه داد تا دانه های موردنظر سرد شده و آب اضافی آنها تبخیر شود. برای این کار می توان دانه ها را روی روزنامه پهن کرد و اجازه داد تا هم سرد شوند و هم اب اضافی آنها گرفته شود. درصد رطوبت دانه ها برای اسپاون بایستی حدود ۳۸ تا ۵۴ باشد. رطوبت – ٪۳۸ باعث کاهش رشد میسلیوم و رطوبت بیشتر از ۵۵٪ باعث ترغیب رشد باکتری ها می شود.

بعد از این عمل لازم است که کربنات کلسیم و سولفات کلسیم هیدراته به مخلوط دانه ها اضافه شود سولفات کلسیم هیدراته از به هم چسبیدن و لزج شدن دانه ها جلوگیری می کند و کربنات کلسیم pH دانه را تنظیم می نماید. درجه pH دانه ها باید تاحدودی خنثی باشد. یعنی pH آن در محدوده ۶٫۵ تا ۷٫۲ باشد. اینکه چه میزان باید از این دو ماده استفاده کرد، در منابع مختلف به صورت متفاوت ارائه شده است که به برخی از آنها اشاره می گردد و

  • استفاده از ۲٪ سولفات کلسیم و ۶٪ کربنات کلسیم (از نظر وزنی).
  • استفاده از ۱۲ گرم کربنات کلسیم و ۱۲ گرم سولفات کلسیم هیدراته به ازای هر یک کیلوگرم وزن خشکدانه گندم.
  • استفاده از تفاله برگ های چای (به عنوان تأمین کننده کربنات کلسیم) به همراه دانه های جوشیده به نسبت 1:1
ج) استریل کردن دانه ها

بعد از اتمام مراحل قبلی، ۳۰۰ گرم مخلوط حاصل را در ظروف شیشه ای پیرکس یک لیتری قرار میدهیم. سپس دهانه ظروف را با فویل آلومینیومی به خوبی می پوشانیم (در تولید تجاری، از ظروف پلاستیکی سلوفان با درپوش پنبه ای استفاده می شود. بعد از پر کردن ظروف باید آنهارا استریل (سترون) کرد. سترون سازی مسئله مهمی در فرایند تولید اسپاون است، به طوری که سترون سازی ناقص عامل مهمی در ایجاد آلودگی های بعدی در اسپاون می باشد. روش های متفاوتی برای سترون سازی دانه های داخل ظروف ذکر شده است که به برخی از آنها اشاره می شود: .

(۱) استفاده از اشعه گاما.

۲)استفاده از اتوکلاو با شرایط فشار ۱۵۴ بار و درجه حرارت ۱۲۱٫۵°C. مدت زمان اتو کلاو به حجم ماده ای که درون اتوکلاو گذاشته می شود بستگی دارد. این مدت می تواند بین یک تا دو ساعت متفاوت باشد. برای اطمینان بیشتر می توان دو بار ماده زمینه ای را اتو کلاو کرد و هر بار مدت اتوکلاو را ۴۵ دقیقه در نظر گرفت.در هنگام اتوکلاو کردن، ابتدا بایستی دریچه خروج هوای اتوکلاو به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه پس از جوش آمدن آب و تولید بخار باز باشد تا هوای آلوده درون اتوکلاو خارج شود. سپس باید شیر خروج اتوکلاو را بست تا به مدت لازم برای مایعات ۱۵ تا ۲۰ دقیقه در فشار معین اتوکلاو روشن بماند. برای کیسه های حاوی ۵۰۰ گرم دانه گندم، بسته به تعداد کیسه ها و ظرفیت اتوکلاو، ۱٫۵ تا ۲ ساعت اتو کلاو لازم است.

(3) اضافه کردن آب اکسیژنه.

آب اکسیژنه باعث میشود تا کشت ها توسط باکتری های غیر هوازی دچارآلودگی نشوند. چرا که میسلیوم قارچ، آب اکسیژنه اضافه شده را می شکند و اکسیژن آن را آزاد می کند و لذا شرایط برای رشد باکتری های غیر هوازی نامساعد میشود. آب اکسیژنه آلودگی ها را از بین می برد بدون آنکه باعث ایجاد نژادهای جدید مقاوم بشود.

در حالی که آنتی بیوتیک ها فقط باکتری های حساس را می کشند و می توانند برای موتانهای مقاوم به آنتی بیوتیک نوعی شرایط انتخابی ایجاد کنند. برای استفاده از آب اکسیژنه می توان از پراکسید هیدروژن (محلول ۳٪) استفاده کرد. از مزیت های این ماده می توان به موارد زیر اشاره نمود: ارزان بودن، نداشتن بو، عدم ایجاد آلرژی، سمیت پایین، باثبات بودن، به آسانی در دسترس بودن، سهولت استفاده، عدم ایجاد آلودگی برای محیط و قابل تجزیه بودن. آنزیم هایی در کاه و کلش غلات وجود دارند که آب اکسیژنه را تخریب می کنند.

بنابراین، لازم است تا این آنزیم ها قبل از اینکه آب اکسیژنه اضافه شود، حذف گردند. معمولا کاه و کلش را در دمای ۱۵۰°C به مدت چندین ساعت یا در اتاق بخار به مدت ۲۴ ساعت قرار می دهند. البته سایر مواد زمینه ای چنین مشکلی را ندارند و فقط در مورد کاه و کلش این مشکل پیش می آید. آب اکسیژنه برروی اسپورهای قارچ های خوراکی تأثیر منفی دارد.

بنابراین، اگر می خواهید تندش اسپور داشته باشید، ابتدا باید آن را در یک محیط کشت بدون آب اکسیژنه کشت دهید و سپس میسلیوم ها را به محیط کشت حاوی آب اکسیژنه منتقل کنید. آب اکسیژنه را نمی توان در کشت مایع به کار برد زیرا در کشت مایع نیز آنزیم هایی آزاد می شود که مولکول آب اکسیژنه را تجزیه می کند.

در مواقعی که آلودگی باکتریایی در محیط کشت زیاد است، می توان از آنتی بیوتیک های عمومی مانند جنتامایسین یا تتراسایکلین استفاده کرد. جنتامایسین خاصیت خود را در اثر اتوکلاو از دست نمی دهد، لذا می توان آن را قبل از اتو کلاو کردن به محیط اضافه کرد. اما تتراسایکلین و بسیاری آنتی بیوتیک های دیگر را بایستی بعد از اتو کلاو کردن اضافه کرد.

موارد کاربرد آب اکسیژنه:

الف) در کشت های میسلیوم در ظروف پتری. آب اکسیژنه را به محیط کشت آگار اضافه می کنیم. نیازی به استفاده از دستکش یا امکانات استریل برای جلو گیری از آلودگی نیست. سپس از کشتهای مربوطهبرای تلقیح دانه های گندم استفاده می کنیم.

ب) در اسپاون. آب اکسیژنه را به ماده زمینه ای اسپاون اضافه می کنیم. نیازی به استفاده از هود استریل نیست. از اسپاون به دست آمده برای مایه زنی بستر کشت استفاده می کنیم.

 تلقیح دانه ها با کشت خالص

به 2 استریل کردن نمونه ها، ظروف به مکانی به دور از آلودگی منتقل می شوند تا به تدریج سرد شوند، به طوری که درجه حرارت دانه های داخل ظرف با درجه حرارت ظرف یکسان شده و هردو به ۲۵- ۲۷°C برسند. بعد از سردشدن، در زیر هود استریل، قطعه ای به قطر یک سانتی متر مربع از یک کشت میسلیوم خالص تازه برداشته و به داخل هر ظرف منتقل می کنیم. این قطعه تلقیحی ترجیحا بهتر است در قسمت های زیرین توده دانهها، ولی چسبیده به دیواره داخلی ظرف قرار گیرد، به طوری که نحوه گسترش میسلیوم در داخل دانه های گندم از بیرون ظرف شیشه ای قابل رؤیت باشد. به هر ظرف می توان یک تا چند تا از این قطعات تلقیحی اضافه کرد. همچنین می توان هنگام تلقيح از اسپاون مادری نیز استفاده کرد. اسپاون مادری در واقع یک اسپاون از قبل آماده است و باعث می شود که اسپاون اصلی سریعتر آماده شود. معمولا به ازای هر ۱۰۰ گرم از مخلوط، ۳ گرم از اسپاون فعال و تازه مادری استفاده می گردد.

 نگهداری اسپان:

بعد از اتمام تلقيح، ظروف یا کیسه های اسپان بایستی به اتاقی با درجه حرارت ترجيحة ۲۳- ۲۵°C منتقل شوند. مدت ۱۲ تا ۱۸ روز برای رسیدن به یک اسپان مناسب، ضروری است. در طی این مدت باید از به هم زدن و تکان دادن شدید ظروف خودداری کرد چرا که این کار باعث می شود هیف ها از هم گسسته شوند و زمان تکمیل اسپاون به تأخیر بیافتد. ولی توصیه می شود ظروف هر سه یا چهار روز یک بار به آرامی تکان داده شوند. در اسپاون نوع تجاری، نیز شرایط نگهداری به همین ترتیب است و تنها طریقه بستن ظروف پلاستیکی تفاوت می کند .

ویژگیهای کیفی یک اسپاون مطلوب

بعد از اتمام مراحل تهیه اسپاون می توان تا حدودی با کنترل برخی شاخصها فهمید که آیا اسپاون تولیدی ارزش مایه زنی برای تولید قارچ را دارد یا خیر. برخی از مهمترین این شاخص ها عبارت اند از:

  • باید شبکه میسلیومی اطراف تمام دانه ها را پوشانده باشد.
  • رشد شبکه میسلیومی باید به صورت رشته ای باشد. نوع پنبه ای بعد، ممکن است باعث تشکیل بافت نمدی روی لایه خاک پوششی شود و در امر تولید قارچ مشکلاتی را پدید آورد.
  • رنگ میسلیوم در یک اسپاون تازه باید سفید باشد. رنگ قهوه ای نشان دهنده کهنه شدن اسپاون تولیدی است. توصیه اکید می شود اسپاون مورداستفاده در مایه زنی تازه باشد. یعنی هنوز در حال پر کردن ماده زمینه ای بوده و فعال باشد. در صورت لزوم حداکثر سه ماه می توان اسپاون آماده را در یخچال برایمایه زنی نگهداری کرد.
  • اسپاون تولیدی نباید لزج شده باشد، چرا که این لزجی دلیل وجود آلودگی باکتریایی است.
  • لکه های سبز و سیاه، که معمولا نشان دهنده آلودگی قارچی است، نباید در اسپاون تولیدی دیده شود.
  •   اسپاون نباید بوی ترشیدگی بدهد. این بو نشانه آلودگی باکتریایی است.

 

 

 

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا